ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Авторы
Файлы

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К⁺-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [¹⁵N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [¹⁵N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.

ФОРМЫ ДОПОЛНИТЕЛЬНОГО ХИМИКО-ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ В ВУЗЕ

Статья в формате PDF 157 KB...

26 04 2024 4:17:12

ПОСТРОЕНИЕ ИНТЕГРИРОВАННОГО КУРСА «ИНФОРМАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ЭКОНОМИКЕ» В ВУЗЕ

Статья в формате PDF 114 KB...

25 04 2024 0:43:46

ИСКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ АВТОРСКИЕ И СМЕЖНЫЕ ПРАВА И ИХ ОГРАНИЧЕНИЯ

Статья в формате PDF 82 KB...

24 04 2024 15:17:23

РАСЧЁТ УГЛОВЫХ КОЭФФИЦИЕНТОВ ЛУЧИСТОГО ТЕПЛООБМЕНА МЕЖДУ СТЕНКАМИ БЕСКОНЕЧНО ДЛИННОГО КАНАЛА

Статья в формате PDF 103 KB...

23 04 2024 0:12:10

РОЛЬ КУЛЬТУРНЫХ ИННОВАЦИЙ В РАЗВИТИИ ОБЩЕСТВА

Статья в формате PDF 139 KB...

22 04 2024 10:31:45

НАЧАЛЬНЫЕ ЭТАПЫ НАУЧНОГО ИЗУЧЕНИЯ ПРИРОДНЫХ УСЛОВИЙ И ТЕРИОФАУНЫ КАВКАЗА

В статье рассматриваются основные начальные этапы научного изучения природных условий и фауны млекопитающих Кавказа. Рассмотрен вклад выдающихся научных деятелей России в становление и развитие отечественной териологии на Кавказе, приводятся интересные сведения об отдельных биографических моментах ученых, связанных с освоением изучаемой территории. ...

21 04 2024 7:12:56

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ ЕСТЕСТВОЗНАНИЯ

Статья в формате PDF 199 KB...

20 04 2024 18:14:23

ОСНОВАНИЯ ГЕОМЕТРИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

Статья в формате PDF 429 KB...

19 04 2024 7:20:29

СИСТЕМОГЕНЕЗ ВНЕШНЕГО ДЫХАНИЯ У ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ ПРЕПУБЕРТАТНОГО ВОЗРАСТА

Статья в формате PDF 99 KB...

18 04 2024 16:49:47

ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ СЕГОЛЕТОК КАРПА ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

Изучено влияние солей кадмия, свинца и марганца на содержание белков в сыворотке крови сеголеток карпа. Показаны разнонаправленные изменения белкового состава сыворотки крови рыб при воздействии солей тяжелых металлов, о чем можно судить на основании изменения А/G индекса. При хроническом действии ионов кадмия отмечено значительное преобладание суммарного содержания альбуминов над глобулинами на протяжении всего эксперимента, пребывание рыб в среде с ионами свинца сопровождалось более значительным ростом содержания глобулинов, тогда как при действии ионов марганца не выявлен однонаправленный хаpaктер изменения соотношения альбуминов и глобулинов. ...