АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА СУХИХ ЭКСТРАКТОВ ИЗ СЫРЬЯ ВИДОВ РОДА VERONICA L.

Немерешина О.Н. Гусев Н.Ф. Филиппова А.В. Сычева М.В. Статья посвящена вопросам изучения антимикробных свойств природных биологически активных соединений – флавоноидов и фенолкарбоновых кислот, извлекаемых методом вихревой турбоэкстракции из сырья растений рода Veronica L. (сем. Scrophulariaceae Juss.) Предуралья. На основании проведенного исследования авторы делают вывод о возможности применения растительного сырья Veronica L. в медицинской практике. Статья в формате PDF 372 KB

Лекарственные препараты, получаемые из растений, занимают достойное место среди средств профилактики и лечения многих заболеваний. На сегодняшний день в Государственном реестре лекарственных средств МЗ РФ приведено около 300 видов растений, применяемых в научной медицине и используемых для приготовления лекарственных средств [5]. В целом же в фитотерапии - научной и народной медицине, гомеопатии и ветеринарии используется около двух тысяч видов растений [12]. При этом биоразнообразие лекарственных растений используется далеко не полностью, что связано с отсутствием данных о ресурсах, недостатком сведений о химическом составе растительного сырья и малой изученностью фармакологических свойств фитопрепаратов [7].

Повсеместное распространение многих лекарственных растений, дешевизна получаемых из них препаратов и высокая физиологическая активность комплекса биологически активных (действующих) веществ - все это не может не привлекать внимание исследователей. Поэтому, одной из актуальных проблем медицинской и биологической науки является поиск новых источников лекарственного растительного сырья, способных расширить сырьевую базу и обновить ассортимент лекарственных средств растительного происхождения.

Растения в процессе роста и развития вырабатывают и накапливают вещества первичного и вторичного синтеза. Вещества первичного синтеза - белки, углеводы и липиды, выполняют в клетках энергетическую, пластическую и ряд других функций, обеспечивая процессы жизнедеятельности. Вещества вторичного синтеза представляют собой химические соединения, обладающие фармакологической активностью и способные оказывать регулирующее влияние на процессы обмена в растительных и животных организмах [13, 16]. Компоненты вторичного синтеза - флавоноиды, иридоиды, азотсодержащие вещества, фитонциды, эфирные масла, таниды, гликозиды, сапонины, ферменты, кумарины, органические кислоты, горечи и многие другие соединения, накапливаемые растениями и обладающие фармакологической активностью и терапевтическим действием, принято называть биологически активными веществами (БАВ).

Исследуя флору Предуралья в период экспедиций (1970-1988 и 1999-2010 гг.), мы обратили внимание на растения рода вероника - Veronica L., семейства Норичниковых - Scrophulariaceae Juss., которые имеют обширный ареал в Евразии и часто входят в состав субдоминантов растительных сообществ [8, 9]. Значительное число видов указанного рода широко применяются в фитотерапии нашей страны и ряда стран Западной Европы и Центральной Азии [1, 3, 11, 12, 14, 15].

В народной медицине препараты из растений рода Veronica применяются в качестве противовоспалительных, отхаркивающих, седативных, кровоостанавливающих, антитоксических и ранозаживляющих средств [1, 6, 8, 11, 12, 14, 19]. Некоторые виды рода Veronica обладают противораковым действием [3]. Вероника лекарственная - V. officinalis включена в состав многих сборов, лечебных чаев и биологически активных пищевых добавок [6]. Виды Veronica L. широко используются для лечения кожных болезней в ветеринарной практике, а их препараты, при исследовании на животных, показали эффективность при заболеваниях сердечно-сосудистой системы [6].

Целью нашего исследования являлось установление антибактериальных свойств препаратов, полученных из сырья растений рода Veronica, произрастающих в лесостепной и степной зонах Предуралья.

Из многообразия видов Veronica нами были выбраны наиболее распространенные в регионе представители: V.officinalis L. - в. лекарственная, V. spicata L. - в. колосистая, V. incana L. - в. седая и V. spuria L. - в. ненастоящая.

Материалы и методы исследования

Растительное сырье для исследования (надземная часть - трава) было заготовлено в период цветения растений в различных биомах Предуралья (2007-2010 гг.) и высушивалось воздушно-теневым способом.

В. лекарственная, относящаяся к растениям-мезофитам и встречающаяся в хвойных лесах была собрана в сосновом бору группы ассоциаций Pineta herbosa Кунгурско-Красноуфимской лесостепи Среднего Предуралья (окр. д. Крылово, Красноуфимского района Свердловской области).

В. ненастоящая, являющаяся ксеромезофитом была собрана на остепненных лугах (Александровские сопки, Красноуфимского района Свердловской области).

Два оставшихся вида: в. колосистая и в. седая относятся к группе ксерофитов и ареал их произрастания охватывает степную зону Южного Предуралья. В. колосистая собрана на остепненных лугах в злаково-разнотравных ассоциациях (окрестности с. Каменноозерное Оренбургского р-на, Оренбургской области)., а в. седая - на степных участках (каменистая степь) в типчаково-разнотравной ассоциации (окресности с. Саракташ, Оренбургской области).

На первом этапе нами проводилось фитохимическое исследование растений на содержание основных групп действующих веществ, оказывающих влияние на биологические процессы в растительных и животных организмах. Исследованию подвергались надземные органы растений (трава), собранные в период цветения растений в 2007-2010 гг. Обнаружение, идентификация и количественное определение алкалоидов, флавоноидов, дубильных веществ, сапонинов, кумаринов и иридоидов проводили методами принятыми Всероссийским Институтом Лекарственных Растений (ВИЛР) и Институтом биохимии растений РАН [4, 13, 16].

Для выявления антимикробной активности комплекса биологически активных веществ в видах рода Veronica из сырья растений нами были изготовлены сухие экстракты полифенольных соединений. Сухие экстракты готовили с использованием метода турбоэкстракции [2], основанном на вихревом перемешивании (с количеством оборотов до четырех тысяч в минуту) сырья и экстрагента при одновременном измельчении сырья. В качестве экстрагента использовали воду, нагретую до температуры 40-42 °С и этанол различной концентрации (табл. 1). Вытяжку отстаивали при температуре +5 °С в течение трёх суток, затем фильтровали, сгущали и высушивали в сушильном шкафу при температуре 70 °С. Полученный экстракт - порошок бурого цвета, исследовали на наличие флавоноидов методом двумерной хроматографии на бумаге.

Испытание антибактериальной активности полученных препаратов проводили в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. В качестве тест-микроорганизмов были использованы штаммы, рекомендуемые для исследования препаратов [4, 10, 17]: культура золотистого стафилококка - Staphyloccus aureus, штам-209 и культура кишечной палочки - Escherichia coli, штамм М-17, полученные из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов (г. Москва).

Исследования проводилось нами на жидких питательных средах методом двукратных серийных разведений [10]. Для этого готовили двукратное разведение извлечений в мясопептонном бульоне. Разведение готовили непосредственно в пробирках, подлежащих засеву. В каждом ряду разведений для контроля имели равное количество пробирок с соответствующими разведениями этилового спирта и две пробирки со средой без извлечения, а при исследовании водных извлечений в качестве контроля брали две пробирки со средой без извлечения.

Культуры для экспериментов готовились следующим образом: суточные агаровые культуры переносили петлёй в пробирку с физиологическим раствором, где находилось исходное разведение в 500 млн микробных тел в 1 мл по оптимальному стандарту. Полученную взвесь разводили бульоном, вначале в 100, а затем еще в 10 раз, для того, чтобы получить взвесь микробов содержащую 500 000 микробных тел в 1 мл, которая являлась рабочим разведением культуры. Изготовленную культуру вносили по 1 мл как в пробирки с извлечением, так и в контрольные, не содержащие извлечений.

Бактериальная нагрузка составляла, таким образом, 250 000 микробных тел в 1 мл. Вслед за этим штативы с пробирками помещались в термостат при температуре +37 °С. Результаты опыта учитывались через 20-24 часа. Регистрировали наличие роста (помутнение) или задержку роста в среде за счет бактериостатического действия извлечений. За действующую дозу принимали ту наименьшую концентрацию извлечения, при которой наблюдается задержка роста бактериальных культур [10].

Результаты исследования и их обсуждение

Фитохимическое исследование видов Veronica показало, что в исследуемых растениях наиболее характерными соединениями являются флавоноиды, таниды, азотистые вещества основного характера и иридоиды.

Основными действующими веществами в сырье растений являются флавоноиды группы флавона [6, 8, 13], составляющие комплекс полифенольных соединений. Химическая структура производных флавона - флавоноидов включает два ароматических кольца, соединенных друг с другом трехуглеродным фрагментом (С636):

   

Структура флавоноидов варьирует за счет изменения числа и положения гидроксильных групп, наличия или отсутствия С = O - группы в кольце С, положением кольца В. Флавоноиды способны образовывать гликозиды, эфиры и другие производные, отличающиеся по своим химическим и фармакологическим свойствам.

При исследовании сырья указанных видов Veronica методом двумерной хроматографии на бумаге в растениях обнаружены флавоноиды (до 16 соединений) и фенолкарбоновые кислоты (до 9 веществ). При этом нами [6, 8, 15] выделены и идентифицированы основные флавоноиды вероник: лютеолин (5,7,3´,4´-тетраоксифлавон), апигенин (5,7,4´-триоксифлавон), апигенин-7-β-D-глюкуронид; цинарозид или лютеолин-7-0-β-D-глюкопиранозид (5, 3´, 4´-триоксифлавон-7-0- β-D-глюкопиранозид).

 

Лютеолин-7-глюкозид (5, 7, 3´, 4´-тетраоксифлавон)                          Апигенин (5, 7, 4´-триоксифлавон)

  

Цинарозид (лютеолин7-0-β-D-глюкопиранозид или 5, 3´,4´-триоксифлавон-7-0-β-D-глюкопиранозид)               Гликозид апигенина (апигенин-7-β-D-глюкуронид)

Определение суммы флавоноидов в сырье показало незначительное повышение их содержания в растениях, собранных в степной зоне Южного Предуралья. Наибольшее количество флавоноидов извлекается при использовании в качестве экстрагента 40 и 70%-го этанола. В экстрактах из травы V. officinalis обнаружено шесть основных веществ флавоновой природы, в V. incana - пять, а в V. spicata - семь соединений. Установлено, что основными соединениями в сухих экстрактах являются: лютеолин, апигенин и их гликозиды. Таким образом, исследование содержания суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в препаратах из травы видов Veronica позволяет утверждать, что оптимальным экстрагентом является 40% этанол (таблица).

Для многих флавоноидов установлено антиоксидантное, противомикробное, противовоспалительное, противораковое действие [1, 3, 12, 13, 14, 18, 19], что обусловило широкое применение флавоноидсодержащего растительного сырья для производства лечебных и профилактических средств. Идентифицированные нами в растениях рода Veronica флавоноиды обладают выраженным противовоспалительным и противовирусным действием [1, 15], антиоксидантной активностью и способствуют восстановлению функциональной активности иммунной сис- темы [18, 19].

Кроме флавоноидов в исследуемых растениях нами выявлены фенолкарбоновые кислоты, четыре из которых идентифицированы как кофейная, хлорогеновая, неохлорогеновая и феруловая кислоты [8, 18]. Но в сухих препаратах рода Veronica L. выявлены только три фенолкарбоновые кислоты, две из которых идентифицируются как хлорогеновая и кофейная:

Хлорогеновая кислота

Кофейная кислота

Оценка антимикробного действия препаратов - сухих экстрактов из видов рода Veronica L. и содержание в них флавоноидов

№ п/п

Виды Veronica L.

Используемый экстрагент

Вид микроба и активность

Содержание суммы флавоноидов (%)

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

1

Veronica
оfficinalis L.

Вода

1:80

н/д*

1,04

20% этанол

1:1000

н/д

2,49

30% этанол

1:4000

н/д

4,76

40% этанол

1:4000

н/д

5,62

70% этанол

1:200

н/д

3,13

90% этанол

1:100

н/д

2,68

2

V. spuria L.

Вода

1:80

н/д

1,02

20% этанол

1:4000

н/д

5,98

30% этанол

1:2000

н/д

3,53

40% этанол

1:8000

н/д

7,67

70% этанол

1:2000

н/д

3,66

90% этанол

1:4000

н/д

5,82

3

V. spicata L.

Вода

1:100

н/д

1,12

20% этанол

1:1000

н/д

2,61

30% этанол

1:1000

н/д

2,83

40% этанол

1:2000

н/д

3,92

70% этанол

1:1000

н/д

2,14

90% этанол

1:1000

н/д

2,36

4

V.incana L.

Вода

1:80

н/д

0,96

20% этанол

1:1000

н/д

2,67

30% этанол

1:1000

н/д

2,48

40% этанол

1:4000

н/д

5,87

70% этанол

1:2000

н/д

3,52

90% этанол

1:1000

н/д

2,56

Примечание. * - отсутствие активности (экстракты недеятельны).

Фенолкарбоновые кислоты широко распространены в растениях и обладают антибактериальным и противовоспалительным действием [3, 21, 27], выполняют функции антиоксидантов и оказывают противоопухолевое действие [18, 19].

Помимо флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в сухих экстрактах из травы видов Veronica обнаружены: иридоиды группы аукубина, азотсодержащие вещества (холин), дубильные вещества, незначительное количество сердечных гликозидов, кумаринов и сапонинов.

Все отмеченное позволило нам считать обоснованным применение видов Veronica в современной фитотерапии в связи, с чем нами было проведено исследование антимикробного действия сухих экстрактов, изготовленных на основе сырья указанных растений.

Результаты проведённых опытов показали, что сухие экстракты из из травы видов Veronica: V.spicata, V.officinalis, V.incana, V.spuria обладают антимикробной активностью только в отношении St. aureus, а в отношении E. coli - они недеятельны (таблица). Сухие экстракты из травы перспективных видов Veronica (V. incana, V. officinalis, V. spicata, V. spuria), полученные при использовании в качестве экстрагента 40%-го этилового спирта, содержат максимальное количество суммы флавоноидов (от 3,92 до 7,67%) и обладают наибольшей антимикробной активностью, но только в отношении грамположительных микроорганизмов (до 1:8000). Самое высокое содержание суммы флавоноидов и наибольшая активность отмечены для препаратов из травы V. spuria L. (1:8 000), полученых экстракцией 40%-м этанолом (таблица).

Экстракты, полученные с помощью дистиллированной воды, обладают слабой активностью в отношении грамположительных микроорганизмов (St. aurеus) и недеятельны в отношении E.coli (таблица).

Выводы

  1. Эффективность антимикробного дейст- вия сухих экстрактов из сырья видов Veronica L. зависит от наличия биологически активных веществ и их количественного содержания.
  2. Препараты, полученные из сырья (травы) видов Veronica L. методом турбоэкстракции, характеризуются высоким содержанием суммы флавоноидов и проявляют высокую антимикробную активность in vitro в отношении Staphylococcus aureus.
  3. Сухие экстракты из травы видов Veronica L. показали отсутствие антимикробной активности in vitro в отношении Escherichia coli.
  4. Высокая антимикробная активность сухих экстрактов из травы видов Veronica оfficinalis L., V. spuria L., V. spicata L. и V.incana L. в отношении грамположительных микроорганизмов представляет практический интерес для разработки на их основе антибактериальных и противовоспалительных лекарственных средств.

Список литературы

  1. Бандюкова В.А. Антибактериальная активность флавоноидов некоторых видов цветковых растений // Растительные ресурсы. - 1987. - Т. 23, Вып. 4. - С. 607-611.
  2. Бобылев Р.В. Получение жидкого экстракта методом противоточной вихревой экстракции // Биофармацевтические аспекты получения и назначения лекарств. - М.: Сб. науч.тр. 1-го Моск. мед. ин-та, 1971. - С. 48-49.
  3. Гольдберг Е.Д. Препараты растений в комплексной терапии злокачественных новообразований / Е.Д. Гольберг, Е.П. Зуева. - Томск: Изд-во Томск ун-та, 2000. - 129 с.
  4. Государственная Фармакопея СССР. - 11-е изд.- М.: Медицина,1990. - Вып. 2 -400 с.
  5. Государственный реестр лекарственных средств. Т. 1.- М.: Минздрав России. Фонд фарм. информации, 2001. - 1277 с.
  6. Гусев Н.Ф. Флавоноиды растений рода Veronica L. / Н.Ф. Гусев, Н.М. Гусева, С.В. Теслов // Химия природных соединений. - 1974. - Т. 4 - С. 521.
  7. Гусев Н.Ф. К вопросу о новых перспективных видах лекарственного растительного сырья в южных областях России / Н.Ф. Гусев, О.Н. Немерешина // Известия ОГАУ. - 2008 - № 3(19). - С. 258-261.
  8. Гусев Н.Ф. К исследованию флавоноидов Veronica incana L. Степного Предуралья. / Н.Ф. Гусев, Немерешина О.Н. // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2005. - № 12. - С. 96-99.
  9. Еленевский А.Г. Систематика и география вероник СССР и прилегающих стран. - М.: Наука, 1978. - 258 с.
  10. Кашкин П.Н. Руководство по медицинской микологии / П.Н. Кашкин, Н.Д. Шеклаков. - М.: Медицина, 1978. - 325 с.
  11. Кьосев П.А. Полный справочник лекарственных растений. - М.: Изд-во Эксмо, 2005. - 992 с.
  12. Махлаюк В.П. Лекарственные растения в народной медицине. - М.: Нива России, 1992. - 478 с.
  13. Муравьёва Д.А. Фармакогнозия: учебник / Д.А. Муравьёва, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. - М.: Медицина, 2002. - 4-е изд., перераб., доп. - 656 с.
  14. Насыров Х.М. Антибактериальные свойства некоторых растений семейства норичниковых / Х.М. Насыров, Н.Н. Ворошилова, Ю.А. Глухарёв // Дикорастущие и интродуцируемые полезные растения в Башкирии. - Уфа, 1971. - Вып. 3. - С. 112-116.
  15. Немерешина О.Н. О некоторых аспектах рационального использования лекарственных растений Предуралья / О.Н. Немерешина, Н.Ф. Гусев, В.Н. Зайцева // Известия ОГАУ. - 2009. - № 2(22). - С. 308-311.
  16. Решетникова М.Д. Химический анализ биологически активных веществ лекарственного растительного сырья и продуктов животного происхождения: учебное пособие / М.Д. Решетникова, В.Ф. Левинова, А.В. Хлебников и др.; под ред. проф. Г.И. Олешко. - Пермь: 2004. - 335 с.
  17. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общ. ред. Р.У. Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М., 2005. - 832 с.
  18. Arora A. Modulation of liposomal membrane by flavonoids and isiflavonoids / Arch.Biochem., Biopsis. - 2000. - vol. 373, №1. - P. 102-109.
  19. Rice-Evans C. Structure - antioxidant activity relation-skips of flavonoids and phenolic acids / C. Rice-Evans, N.J. Miller, G. Paganga // Free Radical. Biol.Med. - 1996. - vol. 20, №7. - P. 933-956.





Строительство нового газопровода в Китайскую Народную Республику начнется с декабря в Новгороде.

Для того, чтобы лично курировать этот вопрос от лица Администрации Президента, в город лично прибыл Александр Сергеевич Абрамов. Как утверждает глава городской администрации Галина Орлова , на улице Циолковского целый квартал ветхого жилого фонда будет снесен для разворачивания промзоны строительства.