ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Авторы
Файлы

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К⁺-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [¹⁵N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [¹⁵N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.

ТЕОРИЯ И МЕТОДИКА РАЗВИТИЯ МАТЕМАТИЧЕСКИХ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ У ДЕТЕЙ ДОШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА (учебно-методический комплекс)

Статья в формате PDF 123 KB...

23 05 2026 10:55:25

ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КОЭФФИЦИЕНТА ИНТЕНСИВНОСТИ НАГРЕВА МЕТАЛЛА ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ОПТИМАЛЬНЫХ РЕЖИМОВ РАБОТЫ ЭЛЕКТРОПЕЧНЫХ АГРЕГАТОВ

В статье даются разъяснения к применению зависимости коэффициента интенсивности нагрева (kи.н) металла от тока электрода с целью обеспечения оптимальных электрических и технологических показателей работы электропечных агрегатов для случаев экранированного и неэкранированного горения дуг. Представлено соспоставление скорости нагрева металла и kи.н для двух указанных случаев. ...

22 05 2026 9:59:36

ОСОБЕННОСТИ ПЕРЕДАЧИ ЭКСПРЕССИВНОСТИ ПРИ ПЕРЕВОДЕ ТЕКСТОВ ПОЛИТИЧЕСКОГО ДИСКУРСА

Статья в формате PDF 348 KB...

21 05 2026 9:22:40

Оценка состояния кроветворной СИСТЕМЫ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С ТЕРРИТОРИЙ с низким уровнем радиационного ЗАГРЯЗНЕНия

Исследованы количество клеток и клеточный состав крови и кроветворных органов мелких млекопитающих (Mus musculus, Apodemus sylvaticus, Clethrionomys rutilus) с территорий, подвергшихся радиационному влиянию (Восточно-Уральский радиоактивный след, Свердловская область, Тоцкий радиоактивный след, Оренбургская область). Установлены изменения состава и структуры клеток крови, клеточного состава и концентрации клеток кроветворной ткани в зависимости от вида животных и места их обитания. Влияние на организм мышей и полевок радиационного фактора среды подтверждает обнаружение в тушках животных радионуклидов. ...

20 05 2026 1:24:21

СМЕНА ЛАНДШАФТНОЙ ОБСТАНОВКИ В ОКРЕСТНОСТЯХ Г. КАДНИКОВА

Статья в формате PDF 88 KB...

19 05 2026 3:58:10

ГУМАНИСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ САМООПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИЧНОСТИ КАК СИТУАЦИЯ УСПЕХА

Статья в формате PDF 130 KB...

18 05 2026 20:36:44

КАМЕРНО-ВОКАЛЬНАЯ МУЗЫКА ВЕНСКИХ КЛАССИКОВ: К ПРОБЛЕМЕ ГЕНЕЗИСА И ЭВОЛЮЦИИ ЖАНРА

Статья в формате PDF 120 KB...

17 05 2026 23:16:48

ИНТЕГРАЛЬНЫЕ МЕТАЛЛОПОЛИМЕРНЫЕ КОНСТРУКЦИИ В ГИДРОАВИАЦИИ

Статья в формате PDF 253 KB...

16 05 2026 11:55:45

СТАНОВЛЕНИЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ УМЕНИЙ

Статья в формате PDF 145 KB...

15 05 2026 19:35:15

Стрессовые ситуации в исследовательской деятельности при формировании конкурентноспособного специалиста

Статья в формате PDF 274 KB...

14 05 2026 16:48:51

Акустические волны в многослойных структурах

Статья в формате PDF 123 KB...

13 05 2026 23:40:34

ИССЛЕДОВАНИЕ МАГНИТОГИДРОДИНАМИЧЕСКОЙ НЕУСТОЙЧИВОСТИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ВЗРЫВА ПЛОСКОЙ ФОЛЬГИ

Статья в формате PDF 789 KB...

12 05 2026 13:54:54

ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА KMnO4 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В МЕДИЦИНЕ

Статья в формате PDF 263 KB...

11 05 2026 20:58:34

БИОХИМИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ С ХЛАМИДИЙНОЙ И УРЕАПЛАЗМЕННОЙ ИНФЕКЦИЯМИ В УСЛОВИЯХ СРЕДНЕГО ПРИОБЬЯ (СУРГУТ)

Проведены биохимические и иммунологические исследования крови у больных с урогeнитaльными инфекциями в условиях Среднего Приобья. Отмечены патологические изменения показателей белкового, липидного обменов и активация белков острой фазы. Наблюдалось резкое повышение активности креатинкиназы в крови всех групп больных. Результаты иммунологических исследований показали изменения В-клеточного звена в сторону увеличение уровня иммуноглобулинов IgG, IgA и снижение активности Т-клеточного звена иммунитета. ...

10 05 2026 1:29:53

ИССЛЕДОВАНИЕ ДВИЖЕНИЯ ГРУЗА ПРИ НАЛИЧИИ НЕУДЕРЖИВАЮЩЕЙ СВЯЗИ С ИЗМЕНЯЕМОЙ ГЕОМЕТРИЕЙ

Статья в формате PDF 1190 KB...

09 05 2026 10:21:20

ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ПАТОФИЗИОЛОГИИ

Статья в формате PDF 98 KB...

08 05 2026 3:30:12

БОНДАРЕВ ВЛАДИМИР ИВАНОВИЧ

Статья в формате PDF 117 KB...

07 05 2026 19:44:45

ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАТОРОВ НА ПРОЦЕСС МЕМБРАННОГО ПИЩЕВАРЕНИЯ НА ПРИМЕРЕ РЫБ СЕМЕЙСТВА ЛОСОСЕВЫЕ (SALMONIDAE)

Статья в формате PDF 101 KB...

06 05 2026 0:51:46

АНАЛИЗ КАЧЕСТВА МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ КАК ОСНОВА МАТЕМАТИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ ВОЗМОЖНЫХ УПРАВЛЕНЧЕСКИХ РЕШЕНИЙ

Статья в формате PDF 128 KB...

05 05 2026 19:48:56

ДЕЙСТВИЕ НЕКОТОРЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОРГАНЫ ГОМЕОСТАТИЧЕСКОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ КРИПТОСПОРИДИОЗЕ

Статья в формате PDF 106 KB...

04 05 2026 13:44:58

СОСТОЯНИЕ ПРИБРЕЖНЫХ ЭКОСИСТЕМ ДАГЕСТАНСКОГО РАЙОНА КАСПИЯ В УСЛОВИЯХ АНТРОПОГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

Статья в формате PDF 102 KB...

03 05 2026 17:32:47

ПЕДАГОГИЧЕСКИЕ КУРСЫ ДЛЯ УЧИТЕЛЕЙ НАЧАЛЬНЫХ ЦЕРКОВНЫХ ШКОЛ В РОССИЙСКОЙ ИМПЕРИИ

Статья в формате PDF 313 KB...

02 05 2026 8:16:18

ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ НЕТРАДИЦИОННЫХ КОРМОВЫХ ДОБАВОК

Статья в формате PDF 117 KB...

01 05 2026 5:15:37

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПОДХОДА К УТИЛИЗАЦИИ РТУТЬ СОДЕРЖАЩИХ ОТХОДОВ И ОЧИСТКА РОССИЙСКОЙ НЕФТИ ОТ СЕРЫ

Статья в формате PDF 157 KB...

30 04 2026 15:19:21

МЕТОДОЛОГИЯ И ПРОБЛЕМЫ КАЧЕСТВА И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕПОДАВАНИЯ ОФТАЛЬМОЛОГИИ В СВЯЗИ С БОЛОНСКИЙ ПРОЦЕССОМ

Статья в формате PDF 97 KB...

29 04 2026 3:10:45

К ВОПРОСУ О ПРОБЛЕМЕ ОТБОРА В ФУТБОЛЕ

Статья в формате PDF 262 KB...

28 04 2026 5:49:48

БОЛЕЗНИ ПЕРВИЧНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА У ВЗРОСЛЫХ

Статья в формате PDF 98 KB...

27 04 2026 16:16:30

ЗАДАЧИ И УПРАЖНЕНИЯ ПО МАТЕМАТИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫМ УРАВНЕНИЯМ (учебное пособие)

Статья в формате PDF 103 KB...

26 04 2026 11:54:57

Кристаллографическая картина экспирата у здоровых детей

Статья в формате PDF 116 KB...

25 04 2026 19:58:11

ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩИХ СТРУКТУР АБСОРПТИВНЫХ КЛЕТОК ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ КРЫС ПРИ ПРЕОБЛАДАНИИ В ПИЩЕ БЕЛКОВ

Статья в формате PDF 129 KB...

24 04 2026 1:34:14

ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ ВОДОРАСТВОРИМОГО ФЛЮСА ВФ – 820 ПРИ ПЕРОРАЛЬНОМ, ВНУТРИБРЮШИННОМ, ИНГАЛЯЦИОННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ОРГАНИЗМ

Статья в формате PDF 110 KB...

23 04 2026 9:37:42

МОДЕЛИРОВАНИЕ КВАЗИФРАКТАЛЬНЫХ КОНФИГУРАЦИЙ МЕЖФАЗНЫХ ГРАНИЦ МЕТОДОМ ИТЕРАЦИИ ТРЕУГОЛЬНЫХ ГЕНЕРАТОРОВ КОХА НА 2D СЕТКАХ

Обсуждены методика и некоторые результаты моделирования вероятных конфигураций межфазных границ на поверхности композиционных материалов, полученные методом итерации треугольных генераторов на определенных сетках Кеплера-Шубникова. ...

22 04 2026 14:55:27

АКТИВНОСТЬ КАТАЛАЗЫ В МИТОХОНДРИЯХ РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНОВ СВИНЕЙ

Исследована активность каталазы в митохондриях, супернатанте сердца и печени свиней пород крупной белой, кемеровской и ландрас. В эксперименте установлено, что по активности каталазы в митохондриях лучшими являются свиньи кемеровской породы. ...

21 04 2026 21:19:54

ПРОФЕССИОНАЛЬНО-ЛИЧНОСТНОЕ САМОРАЗВИТИЕ КАК НЕОТЪЕМЛЕМАЯ ЧАСТЬ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ БУДУЩЕГО УЧИТЕЛЯ

Статья в формате PDF 108 KB...

20 04 2026 21:23:36

АНГЛИЙСКИЙ ЯЗЫК (ПОСОБИЕ ПО ПЕРЕВОДУ МЕДИЦИНСКИХ ТЕКСТОВ)

Статья в формате PDF 241 KB...

19 04 2026 15:10:54

ОБЕСПЕЧЕНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ ИСПЫТАНИЯХ ОБРАЗЦОВ ТЕПЛОЗАЩИТНЫХ МАТЕРИАЛОВ В ВЫСОКОТЕМПЕРАТУРНОМ ПОТОКЕ ВОЗДУХА

Статья в формате PDF 79 KB...

18 04 2026 12:46:46

ИССЛЕДОВАНИЕ СОРБЦИОННО-КОАГУЛЯЦИОННЫХ СВОЙСТВ ЗОЛЫ ШЛАМ-ЛИГНИНА

Статья посвящена решению проблемы рекуперации осадка отстойников целлюлозно-бумажной промышленности. Предложено использовать золу шлам-лигнина в качестве высоко эффективного сорбента сточных вод различного состава. ...

17 04 2026 23:10:17

НАЧАЛЬНЫЕ ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ КРАНИАЛЬНЫХ БРЫЖЕЕЧНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ У БЕЛОЙ КРЫСЫ. I. CТРОМАЛЬНАЯ ЗАКЛАДКА

Стромальная закладка краниальных брыжеечных лимфатических узлов происходит у плодов белой крысы 17-18 суток в результате инвaгинации ветвей краниальной брыжеечной и подвздошно-ободочной артерий с окружающей рыхлой соединительной тканью в просвет кишечных лимфатических стволов. ...

16 04 2026 2:35:16

ИНФОРМАЦИОННАЯ КУЛЬТУРА ПРЕПОДАВАТЕЛЯ И ОБНОВЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Статья в формате PDF 330 KB...

15 04 2026 5:49:44

ВОЗРАСТНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВА СТВОЛА ДЕРЕВЬЕВ НА ПРОБНОЙ ПЛОЩАДИ РАЗНОВОЗРАСТНОГО СОСНЯКА

Для растущих деревьев как живых организмов при оценке их пригодности для создания здоровой лесной среды дополнительно следует учитывать существенные биотехнические признаки, отличающиеся от понимания древостоя как склада кругляка. ...

14 04 2026 22:29:48