ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Авторы
Файлы

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К⁺-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [¹⁵N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [¹⁵N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.

ЭНЕРГОСБЕРЕГАЮЩАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ СОРГО В УСЛОВИЯХ АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ

В обзорной статье рассмотрены основные элементы энергосберегающей технологии возделывания сорго в условиях Астpaxaнской области, к которым относятся: подготовка семян к посеву, севооборот, подбор сортов, нормы высева и способы посева, минеральные подкормки, борьба с сорными растениями и болезнями с помощью внесение гербицидов, орошение по фазам роста и развития, с помощью дождевания наименее энергозатратных агрегатов. ...

02 07 2026 20:27:32

БОЕВАЯ ГОТОВНОСТЬ И ТЕХНИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ АВИАЦИОННОЙ ТЕХНИКИ (учебное пособие)

Статья в формате PDF 98 KB...

01 07 2026 6:18:16

ПРОБЛЕМЫ И ПРОТИВОРЕЧИЯ ОБЩЕХИМИЧЕСКОЙ ПОДГОТОВКИ ИНЖЕНЕРОВ-ТЕХНОЛОГОВ В ТЕХНИЧЕСКОМ ВУЗЕ

Статья в формате PDF 114 KB...

30 06 2026 4:11:14

ВЛИЯНИЕ АТОМНО-СТРУКТУРНЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ НА КОЭРЦИТИВНУЮ СИЛУ ЖЕЛЕЗО-НИКЕЛЕВЫХ ПЛЕНОК

Статья в формате PDF 91 KB...

29 06 2026 18:16:46

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕЗИСА КОТЛОВИНЫ ТЕПЛЯКОВСКОГО ОЗЕРА (ИВАНОВСКАЯ ОБЛАСТЬ)

Статья в формате PDF 267 KB...

28 06 2026 0:39:16

СПЕЦИФИКА ДЕМОГРАФИЧЕСКОЙ И СЕМЕЙНОЙ ПОЛИТИКИ В КАБАРДИНО-БАЛКАРСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ

В статье авторами рассмотрены региональные особенности демографической и семейной политики. ...

27 06 2026 12:45:57

УЛЬТРАСТРУКТУРА ЭПИТЕЛИОЦИТОВ ТОЛСТОГО ОТДЕЛА КИШЕЧНИКА НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛЯТ

Статья в формате PDF 119 KB...

26 06 2026 19:50:55

МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ПОЧЕК И НАДПОЧЕЧНИКОВ ПРИ ВЛИЯНИИ СТРЕССА И РАЗЛИЧНЫХ ЧАСТОТНЫХ РЕЖИМОВ ЭМИ

Статья в формате PDF 116 KB...

25 06 2026 21:28:23

АНАЛИЗ ЛЕТАЛЬНОСТИ ПРИ ТЕРМИНАЛЬНЫХ СТАДИЯХ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ГУЗ КРАЕВОЙ ПТД №1 «ФТИЗИОПУЛЬМОНОЛОГИЯ»

Статья в формате PDF 244 KB...

24 06 2026 11:13:25

К ВОПРОСУ О ПОВЫШЕНИИ КАЧЕСТВА ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО УРОВНЯ ЗНАНИЙ НА ЭТАПАХ ОТ ОБУЧЕНИЯ В ВУЗЕ ДО ОБУЧЕНИЯ В АСПИРАНТУРЕ 

Статья в формате PDF 220 KB...

23 06 2026 18:47:22

ЗАДАЧА О СОЗДАНИИ КИНЕМАТИЧЕСКИХ ПАР КВАЗИВЫСОКИХ КЛАССОВ

Статья в формате PDF 373 KB...

22 06 2026 5:50:46

ОПТИМАЛЬНОЕ РЕШЕНИЕ ЗАДАЧИ УПРАВЛЕНИЯ ПРЕПОДАВАТЕЛЬСКОЙ СТРУКТУРОЙ КАФЕДРЫ

Статья в формате PDF 149 KB...

21 06 2026 18:33:28

ВЗАИМОСВЯЗЬ ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА С РАЗВИТИЕМ РАКА ЖЕЛУДКА

Статья в формате PDF 124 KB...

20 06 2026 8:29:42

ВЛИЯНИЕ ИОНОВ МЕДИ НА ИНСЕКТИЦИДНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ДИМЕТОАТА

Статья в формате PDF 92 KB...

19 06 2026 4:53:45

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОРИСТОСТИ ГРАНУЛ БЫСТРОРАСТВОРИМОГО КИСЕЛЯ НА ОСНОВЕ МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ

Статья в формате PDF 111 KB...

18 06 2026 1:30:30

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ПАПИЛЛОМОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ В ПЛАЦЕНТЕ И ЭНДОМЕТРИИ ПРИ САМОПРОИЗВОЛЬНЫХ ВЫКИДЫШАХ

Статья в формате PDF 227 KB...

17 06 2026 2:28:56

ВОЗДЕЙСТВИЕ НЕФТЕПРОДУКТОВ НА ГИДРОСФЕРУ ЗЕМЛИ

Статья в формате PDF 86 KB...

16 06 2026 0:34:12

БЛОКАТОРЫ β1-РЕЦЕПТОРОВ В КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ

Статья в формате PDF 112 KB...

15 06 2026 7:58:31

Состояние гепатобилиарной системы у больных ревматоидным артритом

Статья в формате PDF 120 KB...

14 06 2026 3:45:18

ИЗУЧЕНИЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНО ВАЖНЫХ КАЧЕСТВ СПЕЦИАЛИСТОВ ЭКОНОМИСТОВ – МЕНЕДЖЕРОВ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

Статья в формате PDF 331 KB...

13 06 2026 3:24:43

ПРИМЕНЕНИЕ ЗОЛЫ-УНОСА ТЭЦ ОАО «ИРКУТСКЭНЕРГО» ДЛЯ ХИМИЧЕСКОЙ МЕЛИОРАЦИИ КИСЛЫХ ПОЧВ

Статья в формате PDF 131 KB...

12 06 2026 18:27:15

Максимальная скорость окисления оксида азота

Статья в формате PDF 344 KB...

11 06 2026 0:22:17

ПРОЯВЛЕНИЯ АГРЕССИВНОСТИ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РАЗЛИЧНЫХ ГРУПП КРОВИ

Статья в формате PDF 126 KB...

10 06 2026 13:30:36

ОХРАНА И ЗАЩИТА, ОБУСТРОЙСТВО, ИНДИКАЦИЯ И ТЕСТИРОВАНИЕ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

Статья в формате PDF 286 KB...

09 06 2026 10:45:21

РАЗРАБОТКА АВТОМАТИЧЕСКОЙ ТРАНСМИССИИ ЛЕГКОВОГО АВТОМОБИЛЯ С ГИБРИДНОЙ ЭНЕРГОСИЛОВОЙ УСТАНОВКОЙ

Статья в формате PDF 113 KB...

08 06 2026 15:59:56

ИНТЕРЬЕРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИМПОРТНЫХ ХРЯКОВ В УСЛОВИЯХ СРЕДНЕГО ПОВОЛЖЬЯ

Статья в формате PDF 87 KB...

07 06 2026 14:56:21

К ВОПРОСУ О ТРАНСФОРМАЦИИ НАЦИОНАЛЬНЫХ ЦЕННОСТЕЙ КИТАЯ В УСЛОВИЯХ ГЛОБАЛИЗАЦИИ

Статья в формате PDF 251 KB...

06 06 2026 6:46:31

НОВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПОДГОТОВКИ ЭЛЕКТРОННЫХ МОРСКИХ АТЛАСОВ ДЛЯ НАУЧНОЙ И ПРАКТИЧЕСКОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ В ЕДИНОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ СИСТЕМЕ ИНФОРМАЦИИ ОБ ОБСТАНОВКЕ В МИРОВОМ ОКЕАНЕ

Статья в формате PDF 130 KB...

05 06 2026 15:44:44

ИНФОРМАЦИОННАЯ ПОГОТОВКА УЧИТЕЛЕЙ ИНФОРМАТИКИ В УСЛОВИЯХ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ИННОВАЦИОННОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ

Статья в формате PDF 132 KB...

04 06 2026 22:40:51

ИММУННЫЙ ГОМЕОСТАЗ У БОЛЬНЫХ, ПРООПЕРИРОВАННЫХ ПО ПОВОДУ УЗЛОВОГО ЗОБА

Изучено состояние иммунной системы у прооперированных больных с узловыми образованиями щитовидной железы. Установлено достоверное снижение абсолютных показателей иммунитета в клеточных и гумopaльных звеньях. В основе механизмов нарушений регуляции иммунного ответа лежат как модуляции свойств отдельных популяций иммуннокомпетентных клеток, так и на молекулярно-генетическом уровне за счет изменения экспрессии генов цитокинов. Выявлена тесная взаимозависимость нейроэндокринной и иммунной систем в реабилитации иммунного гомеостаза в пост операционный период. Для оценки иммунного статуса определялся субпопуляционный состав лимфацитов периферической крови и иммуноглобулины. Исследована клиническая эффективность комплексного применения иммуномодуляторов и тиреоидных препаратов. Обосновано применение в комплексном лечении послеоперационных пациентов с узловым зобом иммунофана, нуклеината натрия в комплексе с гормональными препаратами. ...

03 06 2026 12:42:50

ИСПЫТАНИЕ РАСТУЩЕГО ДЕРЕВА

По результатам измерений ширины годичных слоев на рабочей части керна и определения радиального роста дерева, и последующей идентификации по ним статистической закономерности, выполняют прогнозирование на ретроспективу на число лет с начала рабочей зоны керна до момента начала жизни измеряемого учетного дерева. ...

02 06 2026 15:54:48

О ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ДВИЖУЩИХСЯ ТЕЛ

В статье рассматривается взаимодействие тел при различных скоростях и делается вывод о несправедливости постулата о постоянстве скорости света относительно любой системы отсчета. Дается также понятное с точки зрения классической механики объяснение зависимости длины и времени от скорости. ...