ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Авторы
Файлы

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К⁺-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [¹⁵N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [¹⁵N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.

АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ КАК МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРНЫХ СВОЙСТВ КАРБОГИДРАЗ

Статья в формате PDF 97 KB...

31 08 2026 21:20:51

ФОРМИРОВАНИЕ И КАДРОВОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ РЕГИОНАЛЬНОГО НАУЧНО-ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО КОМПЛЕКСА РЕСПУБЛИКИ ТЫВА

Статья в формате PDF 99 KB...

30 08 2026 9:31:33

НУЖДАЕМОСТЬ МОЛОДЫХ ЛЮДЕЙ В ОРТОПЕДИЧЕСКОЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ И ОРТОДОНТИЧЕСКОМ ЛЕЧЕНИИ

Статья в формате PDF 109 KB...

29 08 2026 4:17:19

ГИСТОФИЗИОЛОГИЯ ОРГАНОВ ЖИВОТНЫХ ПРИ ХОЛОДОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ФОНЕ ПРИМЕНЕНИЯ НАПИТКОВ НА ОСНОВЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ

Статья в формате PDF 104 KB...

28 08 2026 15:57:57

Структурные особенности переднего вагусного комплекса у растущих крыс под влиянием иммобилизационного стресса

Статья в формате PDF 115 KB...

27 08 2026 5:38:52

КОНЦЕПТУАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЛИЧНОСТИ «БЕЗОПАСНОГО ТИПА» В НЕПРЕРЫВНОМ ОБРАЗОВАНИИ

В настоящее время в связи с возникновением проблем физического выживания человечества, расширением спектра внутренних и внешних угроз его жизнедеятельности, в системе образования крайне важно формирование личности «безопасного типа». Это – высокоинтеллектуальная личность, хорошо знакомая с современными проблемами безопасности жизни и жизнедеятельности человека, осознающая их исключительную важность, стремящаяся решать эти проблемы и при этом разумно сочетать личные интересы с интересами общества. Суть образования – формирование креативного человека в креативной среде, т.е. воспитание выпускника с устойчивой мотивацией на дальнейшее познание науки, техники, культуры, искусства, самореализацию и самовоспроизводство, которые возможны только при совместной безопасности личности и общества в широком смысле слова – от семьи до всего человечества. ...

26 08 2026 7:25:18

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ПОДГОТОВКИ БУДУЩЕГО УЧИТЕЛЯ К РАБОТЕ В ПРОФИЛЬНОЙ ШКОЛЕ

Статья в формате PDF 119 KB...

25 08 2026 23:34:23

ЭФФЕКТИВНЫЙ ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЙ ПРИВОД ДЛЯ ТРАНСПОРТНОЙ МАШИНЫ

Статья в формате PDF 110 KB...

24 08 2026 19:31:42

ПРОДУКТИВНОСТЬ САХАРНОГО СОРГО В УСЛОВИЯХ КУРСКОЙ ОБЛАСТИ

Статья в формате PDF 127 KB...

23 08 2026 18:11:30

БИОДЕСТРУКЦИЯ НЕКОТОРЫХ ЛИГНОСУЛЬФОНАТНЫХ БУРОВЫХ РЕАГЕНТОВ В ЖИДКОЙ СРЕДЕ

Статья в формате PDF 147 KB...

22 08 2026 2:32:28

ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГАЗОБЕТОНА

Темпы жилищного и гражданского строительства в Восточной Сибири и соседних регионах сдерживаются высокой себестоимостью строительства. Основным резервом для снижения стоимости является замена дорогостоящих традиционных материалов, в частности стеновых, на альтернативные материалыЯчеистые бетоны из техногенных промышленных отходов. ...

21 08 2026 22:24:12

ЭЛЕКТРОННЫЕ ДЕНЬГИ: ИСТОРИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ И РАЗВИТИЯ

Статья в формате PDF 257 KB...

20 08 2026 21:26:20

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗМЕНЕНИЙ ГЕМОСТАЗА У БОЛЬНЫХ Β1+Β2-АДРЕНОЗАВИСИМЫМ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИМ ТИПОМ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ, ПОЛУЧАВШИХ АТЕНОЛОЛ И АТЕНОЛОЛ В КОМБИНАЦИИ С ДИПИРИДАМОЛОМ

Статья в формате PDF 205 KB...

19 08 2026 3:14:15

ПРОБЛЕМЫ РАЦИОНАЛЬНОГО ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ И ОХРАНЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА ТЕРРИТОРИИ СРЕДНЕГО ПРИОБЬЯ

Статья в формате PDF 136 KB...

18 08 2026 3:54:48

ДИНАМИКА РАЗВИТИЯ РЕЛИГИОЗНОЙ СИТУАЦИИ В СОЧИ НА РУБЕЖЕ XX-XXI ВЕКОВ

Статья в формате PDF 242 KB...

17 08 2026 21:47:22

ПОЖИЛЫЕ И СТАРЫЕ ЛЮДИ: ПСИХОЛОГИЯ ЛИЧНОСТИ ПОСЛЕ ЛЕЧЕНИЯ ПЕРЕЛОМОВ

Статья в формате PDF 120 KB...

16 08 2026 9:59:25

УПРАВЛЕНИЕ КОНФЛИКТАМИ В ПЕДАГОГИЧЕСКОМ КОЛЛЕКТИВЕ

Статья в формате PDF 174 KB...

15 08 2026 17:19:50

ОЦЕНКА ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО ПСИХОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА С МАСТОПАТИЕЙ

Статья в формате PDF 103 KB...

14 08 2026 20:13:43

Проблемы здорового питания населения отдельных регионов России

Рассматриваются проблемы поступления минеральных веществ в организм человека, суточное потрeбление и хаpaктерные симптомы дефицита химических элементов. Подчеркивается особая роль йода и селена в питании человека. Отмечается, что ряд дикорастущих растений может быть использован в качестве источников микро- и макроэлементов. ...

13 08 2026 5:57:39

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТЕЙ ТАЗА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ АЦЕТАБУЛЯРНОЙ ОБЛАСТИ С ПРИМЕНЕНИЕМ АППАРАТА ВНЕШНЕЙ КОНСТРУКЦИИ

Статья в формате PDF 90 KB...

12 08 2026 0:32:24

Макрои микроскопическая анатомия селезенки при воздействии минеральных ванн

Статья в формате PDF 119 KB...

11 08 2026 3:36:58

СОПРОВОЖДЕНИЕ ТВОРЧЕСКОГО САМОРАЗВИТИЯ ЛИЧНОСТИ В СИСТЕМЕ ОЛИМПИАДНОГО ДВИЖЕНИЯ

Статья в формате PDF 159 KB...

10 08 2026 17:36:26

МЕХАНИЗМ ДЛЯ ПРИСОЕДИНЕНИЯ ОТВЕТВЛЕНИЙ К ДЕЙСТВУЮЩИМ ГАЗОПРОВОДАМ

Статья в формате PDF 98 KB...

09 08 2026 10:10:53

МОНИТОРИНГ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВИННОВСКОЙ РОЩИ

Статья в формате PDF 305 KB...

08 08 2026 6:38:41

ПРИМЕНЕНИЕ ГРИППОЛА И ПОЛИВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ВП-4 ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У ЛИЦ ПОЖИЛОГО ВОЗРАСТА

Статья в формате PDF 240 KB...

07 08 2026 11:58:40

ДОЛГОВРЕМЕННОЕ ИЗМЕНЕНИЕ ДЕФЕКТНОСТИ МОП СТРУКТУР ИНДУЦИРОВАННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЕМ МАГНИТНОГО ПОЛЯ

Статья в формате PDF 152 KB...

06 08 2026 16:41:37

УЧЕНИЕ АРИСТОТЕЛЯ О ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ДУШЕ

Статья в формате PDF 98 KB...

05 08 2026 4:26:51

АКТИВАЦИЯ ПРОЦЕССОВ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ – ТИПОВОЙ ПРОЦЕСС ДЕЗИНТЕГРАЦИИ БИОСИСТЕМЫ ПРИ ОЖОГОВОЙ БОЛЕЗНИ

Комплексное клинико-лабораторное обследование 20-ти больных в динамике ожоговой болезни средней степени тяжести позволило выявить закономерность системных метаболических расстройств в виде активации процессов перекисного окисления липидов. Установлена взаимосвязь чрезмерного накопления в эритроцитах и плазме крови промежуточных продуктов липопероксидации с тяжестью клинических проявлений патологии. В период ожогового шока и токсемии имело место прогрессирующее повышение содержания малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в крови, а положительная клиническая динамика ожоговой болезни у выздоравливающих больных (15 – 25 сутки наблюдения) коррелировала со снижением интенсивности процессов липопероксидации. Выявлена положительная корреляция между повышенным содержанием в крови продуктов липопероксидации, уровнем молекул средних масс и развитием синдрома цитолиза. ...

04 08 2026 11:45:50

К ВОПРОСУ ИЗУЧЕНИЯ СОСТОЯНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ ЛЕГКОАТЛЕТОВ ВЫСОКОГО КЛАССА

Статья в формате PDF 98 KB...

03 08 2026 13:43:46

СОВРЕМЕННОЕ КОМПЛЕКСНОЕ ЛЕЧЕНИЕ БЛИЗОРУКОСТИ С САНАТОРНОЙ РЕАБИЛИТАЦИЕЙ

Статья в формате PDF 114 KB...

02 08 2026 13:10:20

АНАЛИЗ И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ ЗДОРОВЬЯ В Г.НЯГАНЬ.

Статья в формате PDF 112 KB...

01 08 2026 15:18:45

Формирование эффективной стратегии образовательного учреждения

Статья в формате PDF 114 KB...

31 07 2026 15:49:22

ЭПИЛЕПСИЯ И НОВОЕ ПОКОЛЕНИЕ АНТИЭПИЛЕПТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Статья в формате PDF 256 KB...

30 07 2026 11:33:43

ЧИСЛЕННОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ДЕФОРМИРОВАНИЯ КЕРАМИЧЕСКИХ КОМПОЗИТОВ НА СТАДИИ ПРЕДРАЗРУШЕНИЯ

Статья в формате PDF 1227 KB...

29 07 2026 21:45:46

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЛЕВОГО ЖЕЛУДОЧКА СЕРДЦА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ II ФУНКЦИОНАЛЬНОГО КЛАССА

Статья в формате PDF 118 KB...

28 07 2026 17:50:38

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПИД-РЕГУЛЯТОРОВ В СИСТЕМАХ АВТОМАТИЧЕСКОГО УПРАВЛЕНИЯ

Статья в формате PDF 339 KB...

27 07 2026 4:14:29

ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ ФОРМИРОВАНИЯ ПОРИСТОЙ СТРУКТУРЫ УГЛЕРОДСОДЕРЖАЩЕГО МАТЕРИАЛА ИЗ МОДИФИЦИРОВАННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

Статья в формате PDF 363 KB...

26 07 2026 18:12:15

ОПТИМИЗАЦИЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ РАН В ЛЕЧЕНИИ ОТКРЫТЫХ И ОГНЕСТРЕЛЬНЫХ ПЕРЕЛОМОВ

Статья в формате PDF 251 KB...

25 07 2026 5:34:38

О ФИЗИКЕ СЕЙСМИЧЕСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

Рассматриваются процессы формирования и распространения сейсмического излучения на основе ньютоновской механики. В источниках излучения среда приобретает механический импульс, который распространяется в виде пакета, действующего на элементы среды с силой, равной производной импульса по времени передачи. ...

24 07 2026 15:41:53

Компьютерная модель самоустанавливающегося планетарного механизма

Статья в формате PDF 666 KB...

23 07 2026 20:53:54