ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Авторы
Файлы

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К⁺-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [¹⁵N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [¹⁵N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.

ДНИ КВАНТОВОЙ МЕДИЦИНЫ В ЕВРОПЕ

Статья в формате PDF 140 KB...

12 06 2026 17:18:20

ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТВОРОЖНОЙ МАССЫ С ДОБАВЛЕНИЕМ МЁДА

Статья в формате PDF 132 KB...

11 06 2026 15:23:52

ВОЗМОЖНОСТИ ТЕПЛОВИЗИОННОГО МЕТОДА В ДИАГНОСТИКЕ СПАЕК

Статья в формате PDF 266 KB...

10 06 2026 8:38:38

ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТРЕХМЕРНЫХ ДИДАКТИЧЕСКИХ ГЕРОНТОЛОГИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ ЧАСТИЧНЫХ И ПОЛНЫХ АДЕНТИЙ

Статья в формате PDF 181 KB...

09 06 2026 10:37:26

СТУК ИЗ ПРОШЛОГО

Статья в формате PDF 257 KB...

08 06 2026 0:28:40

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ФОРМИРОВАНИЯ ПЛЕНОК ТА2О5 ИЗ ПЛЕНКООБРАЗУЮЩИХ РАСТВОРОВ

Статья в формате PDF 137 KB...

07 06 2026 22:58:45

ПАНКРЕАТИТ КАК ОСЛОЖНЕНИЕ ПАПИЛЛОТОМИЙ – ПРИЧИНЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ, МЕРЫ ПРОФИЛАКТИКИ

На материале 769 клинических наблюдений проведен анализ причин возникновения острого панкреатита после эндоскопической папиллотомии. Установлено, что основой их развития является прямое повреждение главного протока поджелудочной железы. Разработаны способы профилактики постманипуляционных панкреатитов. ...

06 06 2026 19:13:21

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИК СИСТЕМЫ

Статья в формате PDF 124 KB...

05 06 2026 1:57:43

Фториды в лечении воспалительной деструкции костной ткани у больных генерализованным пародонтитом

Статья в формате PDF 110 KB...

04 06 2026 22:14:13

ИЗУЧЕНИЕ КАЧЕСТВЕННЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ИКРЫ ПРЕСНОВОДНЫХ РЫБ ЦЕНТРАЛЬНО-ЧЕРНОЗЕМНОГО РЕГИОНА

Статья в формате PDF 259 KB...

03 06 2026 15:33:57

ЭЛЕМЕНТЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ГЕОМЕТРИИ (учебное пособие)

Статья в формате PDF 98 KB...

02 06 2026 15:28:32

НА ПУТИ СБЛИЖЕНИЯ САНАТОРНО-КУРОРТНОГО ДЕЛА И ЛЕЧЕБНО-ОЗДОРОВИТЕЛЬНОГО ТУРИЗМА

Статья в формате PDF 101 KB...

01 06 2026 13:36:45

ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАТОРОВ НА ПРОЦЕСС МЕМБРАННОГО ПИЩЕВАРЕНИЯ НА ПРИМЕРЕ РЫБ СЕМЕЙСТВА ЛОСОСЕВЫЕ (SALMONIDAE)

Статья в формате PDF 101 KB...

31 05 2026 14:18:38

СИСТЕМАТИКА ПЕРЕПОДГОТОВКИ К ИННОВАЦИОННОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ УЧИТЕЛЕЙ-ПРЕДМЕТНИКОВ В РЕСПУБЛИКЕ КАЗАХСТАН

Статья в формате PDF 114 KB...

30 05 2026 2:58:28

АСПЕКТЫ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ ЛИЧНОСТИ И ПУТИ ИХ ФОРМИРОВАНИЯ

Статья в формате PDF 121 KB...

29 05 2026 9:10:56

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ИМУДОНОМ ХРОНИЧЕСКОГО ПАРОДОНТИТА, СОЧЕТАЮЩЕГОСЯ С ПАТОЛОГИЕЙ НЕБНЫХ МИНДАЛИН

Статья в формате PDF 101 KB...

28 05 2026 5:50:50

ТАЛАЛАЕВ АЛЕКСЕЙ КИРИЛЛОВИЧ

Статья в формате PDF 142 KB...

27 05 2026 18:17:41

О ВЛИЯНИИ ПОСТОЯННОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ НА МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ НАРУШЕНИЯ В ПЕЧЕНИ ПРИ ОСТРОЙ ТОКСИЧЕСКОЙ ГЕПАТОПАТИИ

Статья в формате PDF 119 KB...

26 05 2026 12:29:36

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПИЩЕВОЙ ПОВАРЕНОЙ СОЛИ МАРКИ «ЭКСТРА»

Статья в формате PDF 286 KB...

25 05 2026 10:31:25

«НОВАЯ ЭКОНОМИКА» НА РУБЕЖЕ СТОЛЕТИЙ: МИРОВОЙ КРИЗИС ВЫСОКИХ ТЕХНОЛОГИЙ ИЛИ ВЫСШАЯ СТУПЕНЬ РАЗВИТИЯ ЦИВИЛИЗАЦИИ?

Приводятся основные показатели развития «информационного общества» в конце 20 века. Охаpaктеризованы взаимосвязи наукоемких производственных технологий и информатики, экономики и математики, экономико-математического моделирования управленческих решений. ...

24 05 2026 13:53:33

ЗАДАЧИ И МЕТОДЫ СИСТЕМЫ ПОДДЕРЖКИ ПРИНЯТИЯ УПРАВЛЕНЧЕСКИХ РЕШЕНИЙ В СФЕРЕ СОЦИАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ РЕГИОНА

Статья в формате PDF 133 KB...

23 05 2026 22:27:26

ХАРАКТЕРНЫЕ ОБЛАСТИ ПОДВИЖНОЙ ПЛОСКОСТИ

Статья в формате PDF 944 KB...

22 05 2026 9:34:37

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И КЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ХИРУРГИЧЕСКОГО СТРЕССА

Статья в формате PDF 146 KB...

21 05 2026 20:52:56

МЕЖПРЕДМЕТНЫЕ СВЯЗИ БИОЛОГИИ И ФИЗИКИ: ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА

Статья в формате PDF 121 KB...

20 05 2026 2:57:15

ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОМОДУЛЯТОРА «СПЛЕНОПИДА» И ОЗОНИРОВАНИЯ КРОВИ В ЛЕЧЕНИИ СИНДРОМА ДИАБЕТИЧЕСКОЙ СТОПЫ

Статья в формате PDF 245 KB...

19 05 2026 11:27:53

ПОЛОЖЕНИЕ МОЛОДЕЖИ НА РОССИЙСКОМ РЫНКЕ ТРУДА

Статья в формате PDF 340 KB...

18 05 2026 8:59:51

СОВРЕМЕННЫЙ ПОДХОД К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ НЕОСЛОЖНЕННЫХ ФРОНТИТОВ

Описаны причины развития и особенности лечения больных воспалительными заболеваниями лобных пазух в регионе Северного Кавказа по данным Ростовской ЛОР клиники и ЛОР кафедры Ставропольской Медицинской Академии. Рассмотрены направления в совершенствовании метода трепанопункции в этих клиниках. ...

17 05 2026 23:35:35

О КОНЕЧНЫХ ПОВОРОТАХ ТВЕРДОГО ТЕЛА С НЕПОДВИЖНОЙ ТОЧКОЙ

Статья в формате PDF 590 KB...

16 05 2026 19:36:50

ИННОВАЦИОННАЯ МЕТОДИКА ОБУЧЕНИЯ СТУДЕНТОВ ОБЩЕЙ ХИМИИ В МЕДИЦИНСКОМ ВУЗЕ

Статья в формате PDF 125 KB...

15 05 2026 11:14:34

СИСТЕМА Tl2S-Tl2Te-Tl9SbTe6 И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФАЗОВЫХ ДИАГРАММ РОДСТВЕННЫХ СИСТЕМ

Методами ДТА и РФА исследованы фазовые равновесия в системе Tl2S-Tl2Te-Tl9SbTe6 (А). Построены политермическое сечение Tl2S-Tl9SbTe6 и изотермическое сечение при 400К фазовой диаграммы, а также проекция поверхности ликвидуса системы А. Установлено, что она является квазитройным фрагментом четверной системы Tl-Sb-S-Te и хаpaктеризуется образованием широких областей твердых растворов на основе исходных соединений. Поверхность ликвидуса системы А состоит из трех полей, отвечающих первичной кристаллизации твердых растворов на основе соединений Tl2S, Tl2Te и Tl9SbTe6. В работе также обсуждены особенности фазовых равновесий в аналогичных системах и, в частности, показано, что все шесть систем данного типа хаpaктеризуются образованием твердых растворов на основе исходных соединений, причем наиболее широкие области гомогенности имеют соединения типа Tl9BVX6. ...

14 05 2026 5:11:22

ОТВЕТСТВЕННОСТЬ ЗА НАРУШЕНИЕ В СФЕРЕ ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКИХ УСЛУГ

Статья в формате PDF 250 KB...

13 05 2026 4:11:37

РЕАБИЛИТАЦИЯ ПОДРОСТКОВ С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ В СОЧЕТАНИИ С ОЖИРЕНИЕМ

Статья в формате PDF 316 KB...

12 05 2026 8:27:51

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССОВ ПЛАЗМОХИМИЧЕСКОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ МАГНЕТИТОВЫХ КОНЦЕНТРАТОВ ДРЕВЕСНЫМ СЫРЬЕМ

Статья в формате PDF 123 KB...

11 05 2026 1:55:44

Термофизические основы радиометрических измерений температуры

Предлагается метод измерения температуры, с целью уменьшения погрешности измерений и увеличения точности бесконтактного измерения. Существенной особенностью предлагаемого метода является возможность использования двухступенчатого подхода с предварительной или дополнительной регистрацией состояния системы и теплового излучения для уточнения измерения температуры. ...