ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Авторы
Файлы

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К⁺-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [¹⁵N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [¹⁵N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.

О НЕДОСТАТКАХ В ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ПОДГОТОВКЕ ВРАЧЕЙ В ОБЛАСТИ ДИАГНОСТИКИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПОЛИНЕВРОПАТИЙ В РОССИИ

Статья в формате PDF 121 KB...

11 07 2025 5:33:23

ВЛИЯНИЕ СЛОЖНОКООРДИНАЦИОННЫХ УПРАЖНЕНИЙ НА СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНИЧЕСКИХ ПРИЕМОВ ВОЛЕЙБОЛИСТОК 13-14 ЛЕТ

Статья в формате PDF 249 KB...

10 07 2025 10:37:31

Роль различных двигательных режимов в адаптационном процессе и педагогической деятельности студентов

Статья в формате PDF 111 KB...

09 07 2025 13:55:33

ЗАГРЯЗНЕНИЕ АТМОСФЕРЫ

Статья в формате PDF 104 KB...

08 07 2025 5:25:36

ПАТОЛОГИЯ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ У ЖЕНЩИН С ХРОНИЧЕСИМ ЭНДОМЕТРИТОМ

Статья в формате PDF 235 KB...

07 07 2025 11:29:41

Энергосберегающие технологии. Взгляд в будущее

Статья в формате PDF 360 KB...

06 07 2025 21:46:19

К ВОПРОСУ О НЕОБХОДИМОСТИ ЗНАНИЯ ЕВРОПЕЙСКОГО РЕЧЕВОГО ЭТИКЕТА ПРЕДСТАВИТЕЛЯМИ ТУРИСТИЧЕСКОГО СЕРВИСА

Статья в формате PDF 118 KB...

05 07 2025 15:57:16

ВЫЧИСЛИТЕЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ СОПРЯЖЕННЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ВОСПЛАМЕНЕНИЯ И ГОРЕНИЯ В ПОСТАНОВКЕ СКВОЗНОГО ВЫЧИСЛИТЕЛЬНОГО ЭКСПЕРИМЕНТА

Статья в формате PDF 153 KB...

04 07 2025 10:41:13

ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУННОГО СТАТУСА БОЛЬНЫХ С РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ В ДИНАМИКЕ ЛЕЧЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИНЕРАЛЬНОГО КОМПЛЕКСА «АЗЕОМЕД»

Целью настоящей работы явилась хаpaктеристика иммунного статуса больных с рецидивирующей папилломавирусной инфекцией (ПВИ) в динамике лечения с использованием цеолитсодержащего минерального комплекса «Азеомед». Минеральный комплекс «Азеомед» обладает иммуностимулирующим, адсорбционным и детоксикационным свойствами. Комбинированное лечение включало использование «Азеомед» в дозе 500 мг×2 раза в день в течение 30 дней в комплексе с базисной терапией – индинолом в сочетании с хирургической деструкцией папиллом. У больных отмечалось повышение СД95 + клеток, лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза, а также СД4 + , СД8 + , и NК-клеток. Отсутствие рецидива папиллом в течение 1,6 месяцев отмечалось в 62,9% случаев. ...

03 07 2025 18:26:48

КОНТРОЛЬ И ИЗМЕРЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ДВИЖЕНИЯ ТРАНСПОРТНЫХ СРЕДСТВ С ПОМОЩЬЮ ТЕЛЕВИЗИОННЫХ ИЗМЕРИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМ

Статья в формате PDF 140 KB...

02 07 2025 10:48:46

НОВАЯ ТЕОРИЯ ФАЗОВОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ СЕРДЦА

Сердце – один из самых загадочных органов. Вскрытие грудной полости и рассечение перикарда нарушает целостность сердечной системы, и способность его работать даже в этих условиях приводит к недооценке перикардиальной полости, как важной функциональной пятой камеры сердца. Представленная схема фаз деятельности пятикамерного сердца будет способствовать развитию теории и пpaктики оздоровления человека, спортивной тренировки и лечения болезней сердца. ...

01 07 2025 8:53:16

МЕТОД СИНТЕЗА ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СТРУКТУР ЕХНОЛОГИЧЕСКИХ КОМПЛЕКСОВ ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ

Статья в формате PDF 274 KB...

30 06 2025 17:17:20

УРОВНИ PB И CD В ВОЛОСЕ ЖИВОТНОГО РОДА BOS

Статья в формате PDF 91 KB...

29 06 2025 4:23:40

РОЛЬ КУРСА ОБЖ В ГУМАНИЗАЦИИ ОБЩЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

В процессе воспитания у детей формируется система взглядов на объективный мир, его место в нем, на отношение к окружающей его действительности и самому себе, а также обусловленные этими взглядами жизненные основные позиции, правила поведения в чрезвычайных ситуациях, навыки само и взаимопомощи, ценностные ориентации. Ключевое место в формировании мировоззрения детей занимает в школе предмет основы безопасности жизнедеятельности, призванный стимулировать знания процессов развития личности, формирования и укрепления здоровья, накопление адаптационных ресурсов организма. Содержание курса ОБЖ должно быть направлено на гуманизацию образовательного процесса. Гуманистический подход связан с развитием творческих возможностей человека, созданием реальных безопасных условий для обогащения интеллектуального, эмоционального, волевого и нравственного потенциала личности, стимулированием у нее стремления реализовать себя через активно не адоптированные действия, расширяющие границы самосохранения, саморазвития и самоосуществления. ...

28 06 2025 17:41:24

ВЛИЯНИЕ ТЕРАПИИ БИЛЬТРИЦИДОМ И УРСОСАНОМ НА ЖЕЛЧНЫЙ ЛИТОГЕНЕЗ В РЕЗИДУАЛЬНУЮ ФАЗУ ОПИСТОРХОЗА

Обследовано 19 здоровых людей и 33 пациента с описторхозом и холелитиазом. Проведена сравнительная оценка некоторых показателей холестеринового, пигментного, белкового обмена в пузырной и печеночной порции желчи у обследованных пациентов до и после терапии бильтрицидом и урсосаном. Выявлено, что у пациентов с описторхозом и холелитиазом в эффективные сроки после монотерапии бильтрицидом отмечается значимое превышение концентрации непрямого билирубина, холестерина и белка в пузырной желчи по сравнению со здоровыми людьми, что свидетельствует о сохранении остаточных явлений при значительном улучшении пигментного обмена и снижении литогенных свойств желчи. Включение в схему подготовки и проведения антигельминтной терапии урсосана позволяет достигнуть наибольшего гиполитогенного состояния пузырной порции желчи в эффективные сроки после терапии бильтрицидом. ...

27 06 2025 12:21:52

КАЧЕСТВО ЖИЗНИ ПЕДАГОГОВ ЮГА ТЮМЕНСКОЙ ОБЛАСТИ

Статья в формате PDF 91 KB...

26 06 2025 19:34:47

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ПРЕПАРАТА ФЭТИЛ НА РОСТ И ГОРМОНАЛЬНЫЙ СТАТУС ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ

Статья в формате PDF 159 KB...

25 06 2025 22:55:27

ПРИМЕНЕНИЕ СИСТЕМЫ B2B В ДИСТРИБУТОРСКОЙ КОМПАНИИ

Статья в формате PDF 119 KB...

24 06 2025 18:32:15

РЕАБИЛИТАЦИЯ ДИСБИОТИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ

Статья в формате PDF 155 KB...

23 06 2025 1:59:41

ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ АСПЕКТЫ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ОСМОТРОВ И ПСИХОСОМАТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА

Проведено комплексное психо-соматическое обследование 3280 женщин репродуктивного возраста с мастопатией. Сделан вывод о необходимости организации специализированных маммологических кабинетов для квалифицированной диагностики, лечения и психологической коррекции пациенток с заболеваниями молочных желез. ...

22 06 2025 16:46:44

ПРИОРИТЕТНЫЕ ОТРАСЛИ РАЗВИТИЯ ВОРОНЕЖСКОЙ ОБЛАСТИ

Статья в формате PDF 268 KB...

21 06 2025 19:18:46

КРЕАТИВНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ СОЦИАЛЬНОЙ АДАПТАЦИИ ДЕТЕЙ СТАРШЕГО ДОШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА

Статья в формате PDF 250 KB...

20 06 2025 23:21:35

ВНЕШНИЙ И ВНУТРЕННИЙ МАРКЕТИНГОВЫЙ АНАЛИЗ ПРИ УПРАВЛЕНИИ УГЛЕВОДОРОДНЫМИ ПРОЕКТАМИ

Статья в формате PDF 124 KB...

19 06 2025 17:34:21

ТРАНСПОРТИРОВКА ЛИЧИНОК КАРПА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЦЕОЛИТА

Статья в формате PDF 134 KB...

18 06 2025 0:24:53

УНИВЕРСАЛЬНОЕ ИСКУССТВОЗНАНИЕ КАК НАУЧНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ

В статье доктора искусствоведения профессора Саратовской консерватории, члeна-корреспондента Российской академии естествознания даётся обоснование нового научного направления – универсального искусствознания, целью которого является комплексное исследование художественного процесса с вовлечением всех видов искусства в их глобальном охвате, а также построение художественной картины мира как особого рода исторической памяти. ...

17 06 2025 6:23:39

Принципы оценки гормонального профиля в процессе становления развития репродуктивной функции у девочек и дeвyшек-подростков

Статья в формате PDF 117 KB...

16 06 2025 4:23:20

ТИПОВЫЕ, ПОЛОВЫЕ И ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ТОПОГРАФИИ ТРОЙНИЧНОГО УЗЛА ЧЕЛОВЕКА

Статья в формате PDF 124 KB...

15 06 2025 9:37:11

ВЛИЯНИЕ ЙОДНОГО ДЕФИЦИТА НА ПОКАЗАТЕЛИ УМСТВЕННОЙ РАБОТОСПОСОБНОСТИ У СТУДЕНТОВ И ПРЕПОДАВАТЕЛЕЙ ОГУ

Статья в формате PDF 142 KB...

14 06 2025 23:27:27

СИМУЛЯЦИЯ СЕТИ С ПЕРЕМЕННОЙ ТОПОЛОГИЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПАРАЛЛЕЛЬНЫХ ВЫЧИСЛЕНИЙ

Статья в формате PDF 136 KB...

13 06 2025 1:17:31

ОЦЕНКА ХИМИКО-ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ВОДОЕМОВ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ АНАЛИЗА ВОД И ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ

Статья в формате PDF 124 KB...

12 06 2025 0:37:36

К ВОПРОСУ О ПОВЫШЕНИИ КАЧЕСТВА ОБРАЗОВАНИЯ ЗА СЧЕТ ПРИМЕНЕНИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ ОБУЧЕНИЯ

Статья в формате PDF 103 KB...

11 06 2025 15:48:45

ВЛИЯНИЕ НУТРИТИВНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ НА ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ С ТЯЖЕЛЫМ ВНУТРИМОЗГОВЫМ КРОВОИЗЛИЯНИЕМ

Статья в формате PDF 323 KB...

10 06 2025 10:53:22

СЕЗОННЫЕ БИОРИТМЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ЗВЕНЬЕВ ЛИПИДНОГО МЕТАБОЛИЗМА У НОВОРОЖДЕННЫХ КОРЕННОГО НАСЕЛЕНИЯ КРАЙНЕГО СЕВЕРА

Формирование липидной структуры эритроцитарных мембран в раннем онтогенезе хаpaктеризуется зависимостью от комплекса экстремальных условий Крайнего Севера, которые оказывает десинхронирующее влияние на становление эритроцитарных мембран новорожденных детей, проявляющееся молекулярной реорганизацией липидов, накоплением лизолецитина в зимний период года, что может способствовать их дестабилизации. ...

09 06 2025 8:17:16

СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ СТРОИТЕЛЬНЫХ ЯЧЕИСТЫХ КОМПОЗИТОВ ИЗ ТЕХНОГЕННЫХ ОТХОДОВ

Со дня введения новых СНиПов проектировщики и строители оказались в весьма затруднительном положении. Если строить из традиционных материалов пришлось бы толщину стен увеличить чуть ли не втрое. На наш взгляд, наиболее полно отвечают всем требованиям изделия из газобетона, которые могут одновременно служить стеновым и теплоизоляционным материалом. ...