ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ > Полезные советы
Тысяча полезных мелочей    

ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К+-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [15N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [15N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.


ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КОЭФФИЦИЕНТА ИНТЕНСИВНОСТИ НАГРЕВА МЕТАЛЛА ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ОПТИМАЛЬНЫХ РЕЖИМОВ РАБОТЫ ЭЛЕКТРОПЕЧНЫХ АГРЕГАТОВ

ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КОЭФФИЦИЕНТА ИНТЕНСИВНОСТИ НАГРЕВА МЕТАЛЛА ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ОПТИМАЛЬНЫХ РЕЖИМОВ РАБОТЫ ЭЛЕКТРОПЕЧНЫХ АГРЕГАТОВ В статье даются разъяснения к применению зависимости коэффициента интенсивности нагрева (kи.н) металла от тока электрода с целью обеспечения оптимальных электрических и технологических показателей работы электропечных агрегатов для случаев экранированного и неэкранированного горения дуг. Представлено соспоставление скорости нагрева металла и kи.н для двух указанных случаев. ...

22 05 2026 9:59:36

Оценка состояния кроветворной СИСТЕМЫ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С ТЕРРИТОРИЙ с низким уровнем радиационного ЗАГРЯЗНЕНия

Оценка состояния кроветворной СИСТЕМЫ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С ТЕРРИТОРИЙ с низким уровнем радиационного ЗАГРЯЗНЕНия Исследованы количество клеток и клеточный состав крови и кроветворных органов мелких млекопитающих (Mus musculus, Apodemus sylvaticus, Clethrionomys rutilus) с территорий, подвергшихся радиационному влиянию (Восточно-Уральский радиоактивный след, Свердловская область, Тоцкий радиоактивный след, Оренбургская область). Установлены изменения состава и структуры клеток крови, клеточного состава и концентрации клеток кроветворной ткани в зависимости от вида животных и места их обитания. Влияние на организм мышей и полевок радиационного фактора среды подтверждает обнаружение в тушках животных радионуклидов. ...

20 05 2026 1:24:21

СТАНОВЛЕНИЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ УМЕНИЙ

СТАНОВЛЕНИЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ УМЕНИЙ Статья в формате PDF 145 KB...

15 05 2026 19:35:15

Акустические волны в многослойных структурах

Акустические волны в многослойных структурах Статья в формате PDF 123 KB...

13 05 2026 23:40:34

БИОХИМИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ С ХЛАМИДИЙНОЙ И УРЕАПЛАЗМЕННОЙ ИНФЕКЦИЯМИ В УСЛОВИЯХ СРЕДНЕГО ПРИОБЬЯ (СУРГУТ)

БИОХИМИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ С ХЛАМИДИЙНОЙ И УРЕАПЛАЗМЕННОЙ ИНФЕКЦИЯМИ В УСЛОВИЯХ СРЕДНЕГО ПРИОБЬЯ (СУРГУТ) Проведены биохимические и иммунологические исследования крови у больных с урогeнитaльными инфекциями в условиях Среднего Приобья. Отмечены патологические изменения показателей белкового, липидного обменов и активация белков острой фазы. Наблюдалось резкое повышение активности креатинкиназы в крови всех групп больных. Результаты иммунологических исследований показали изменения В-клеточного звена в сторону увеличение уровня иммуноглобулинов IgG, IgA и снижение активности Т-клеточного звена иммунитета. ...

10 05 2026 1:29:53

БОНДАРЕВ ВЛАДИМИР ИВАНОВИЧ

БОНДАРЕВ ВЛАДИМИР ИВАНОВИЧ Статья в формате PDF 117 KB...

07 05 2026 19:44:45

ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ НЕТРАДИЦИОННЫХ КОРМОВЫХ ДОБАВОК

ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ НЕТРАДИЦИОННЫХ КОРМОВЫХ ДОБАВОК Статья в формате PDF 117 KB...

01 05 2026 5:15:37

К ВОПРОСУ О ПРОБЛЕМЕ ОТБОРА В ФУТБОЛЕ

К ВОПРОСУ О ПРОБЛЕМЕ ОТБОРА В ФУТБОЛЕ Статья в формате PDF 262 KB...

28 04 2026 5:49:48

БОЛЕЗНИ ПЕРВИЧНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА У ВЗРОСЛЫХ

БОЛЕЗНИ ПЕРВИЧНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА У ВЗРОСЛЫХ Статья в формате PDF 98 KB...

27 04 2026 16:16:30

МОДЕЛИРОВАНИЕ КВАЗИФРАКТАЛЬНЫХ КОНФИГУРАЦИЙ МЕЖФАЗНЫХ ГРАНИЦ МЕТОДОМ ИТЕРАЦИИ ТРЕУГОЛЬНЫХ ГЕНЕРАТОРОВ КОХА НА 2D СЕТКАХ

МОДЕЛИРОВАНИЕ КВАЗИФРАКТАЛЬНЫХ КОНФИГУРАЦИЙ МЕЖФАЗНЫХ ГРАНИЦ МЕТОДОМ ИТЕРАЦИИ ТРЕУГОЛЬНЫХ ГЕНЕРАТОРОВ КОХА НА 2D СЕТКАХ Обсуждены методика и некоторые результаты моделирования вероятных конфигураций межфазных границ на поверхности композиционных материалов, полученные методом итерации треугольных генераторов на определенных сетках Кеплера-Шубникова. ...

22 04 2026 14:55:27

АКТИВНОСТЬ КАТАЛАЗЫ В МИТОХОНДРИЯХ РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНОВ СВИНЕЙ

АКТИВНОСТЬ КАТАЛАЗЫ В МИТОХОНДРИЯХ РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНОВ СВИНЕЙ Исследована активность каталазы в митохондриях, супернатанте сердца и печени свиней пород крупной белой, кемеровской и ландрас. В эксперименте установлено, что по активности каталазы в митохондриях лучшими являются свиньи кемеровской породы. ...

21 04 2026 21:19:54

ИССЛЕДОВАНИЕ СОРБЦИОННО-КОАГУЛЯЦИОННЫХ СВОЙСТВ ЗОЛЫ ШЛАМ-ЛИГНИНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СОРБЦИОННО-КОАГУЛЯЦИОННЫХ СВОЙСТВ ЗОЛЫ ШЛАМ-ЛИГНИНА Статья посвящена решению проблемы рекуперации осадка отстойников целлюлозно-бумажной промышленности. Предложено использовать золу шлам-лигнина в качестве высоко эффективного сорбента сточных вод различного состава. ...

17 04 2026 23:10:17

НАЧАЛЬНЫЕ ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ КРАНИАЛЬНЫХ БРЫЖЕЕЧНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ У БЕЛОЙ КРЫСЫ. I. CТРОМАЛЬНАЯ ЗАКЛАДКА

НАЧАЛЬНЫЕ ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ КРАНИАЛЬНЫХ БРЫЖЕЕЧНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ У БЕЛОЙ КРЫСЫ. I. CТРОМАЛЬНАЯ ЗАКЛАДКА Стромальная закладка краниальных брыжеечных лимфатических узлов происходит у плодов белой крысы 17-18 суток в результате инвaгинации ветвей краниальной брыжеечной и подвздошно-ободочной артерий с окружающей рыхлой соединительной тканью в просвет кишечных лимфатических стволов. ...

16 04 2026 2:35:16

ВОЗРАСТНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВА СТВОЛА ДЕРЕВЬЕВ НА ПРОБНОЙ ПЛОЩАДИ РАЗНОВОЗРАСТНОГО СОСНЯКА

ВОЗРАСТНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВА СТВОЛА ДЕРЕВЬЕВ НА ПРОБНОЙ ПЛОЩАДИ РАЗНОВОЗРАСТНОГО СОСНЯКА Для растущих деревьев как живых организмов при оценке их пригодности для создания здоровой лесной среды дополнительно следует учитывать существенные биотехнические признаки, отличающиеся от понимания древостоя как склада кругляка. ...

14 04 2026 22:29:48

Еще:
Поддержать себя -1 :: Поддержать себя -2 :: Поддержать себя -3 :: Поддержать себя -4 :: Поддержать себя -5 :: Поддержать себя -6 :: Поддержать себя -7 :: Поддержать себя -8 :: Поддержать себя -9 :: Поддержать себя -10 :: Поддержать себя -11 :: Поддержать себя -12 :: Поддержать себя -13 :: Поддержать себя -14 :: Поддержать себя -15 :: Поддержать себя -16 :: Поддержать себя -17 :: Поддержать себя -18 :: Поддержать себя -19 :: Поддержать себя -20 :: Поддержать себя -21 :: Поддержать себя -22 :: Поддержать себя -23 :: Поддержать себя -24 :: Поддержать себя -25 :: Поддержать себя -26 :: Поддержать себя -27 :: Поддержать себя -28 :: Поддержать себя -29 :: Поддержать себя -30 :: Поддержать себя -31 :: Поддержать себя -32 :: Поддержать себя -33 :: Поддержать себя -34 :: Поддержать себя -35 :: Поддержать себя -36 :: Поддержать себя -37 :: Поддержать себя -38 ::