Тысяча полезных мелочей    

ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К+-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [15N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [15N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.


ДЕЛОВАЯ ИГРАКАК МЕТОД ПРЕПОДАВАНИЯ КУРА «ЭКОЛОГИЯ»

ДЕЛОВАЯ ИГРАКАК МЕТОД ПРЕПОДАВАНИЯ КУРА «ЭКОЛОГИЯ» Статья в формате PDF 102 KB...

30 10 2026 18:46:48

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ПИТАНИЯ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ПИТАНИЯ  НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ Обсуждаются возможности использования микроскопических почвенных водорослей при оценке качества окружающей среды. Показано, что в качестве критериев при прогнозировании антропогенной нагрузки на наземные экосистемы можно использовать изменение видового состава и численности почвенных водорослей. ...

27 10 2026 2:38:50

Методологические развитие мышление и творчество студентов на медицинском факультете

Методологические развитие мышление и творчество студентов на медицинском факультете Обсуждаются современные методологические аспекты использования активных методов обучения студентов в развитие мышление и творчество. ...

25 10 2026 16:15:19

ТРАНСФОРМАЦИЯ МЕРЗЛОТНЫХ КОМПОНЕНТОВ ЭКОСИСТЕМ ПОД ВЛИЯНИЕМ ПРИРОДНО-ТЕХНИЧЕСКИХ СИСТЕМ

ТРАНСФОРМАЦИЯ МЕРЗЛОТНЫХ КОМПОНЕНТОВ ЭКОСИСТЕМ ПОД ВЛИЯНИЕМ ПРИРОДНО-ТЕХНИЧЕСКИХ СИСТЕМ Экспериментальные исследования на участке распространения пород ледового комплекса выявили увеличение глубины сезонного протаивания и повышение температуры грунтов на прилегающей к железной дороге просеке. Установлено поднятие верхней границы многолетнемерзлых пород под высокой насыпью и низкой насыпью с теплоизолирующим материалом, отсыпанных в зимний сезон. Отмечено формирование чаши протаивания при отсыпке нулевой насыпи в теплый период с удалением сезонноталого слоя в её основания. Предложены мероприятия обеспечивающие устойчивость земляного полотна. ...

20 10 2026 12:46:29

КАРГИН ИВАН ФЕДОРОВИЧ

КАРГИН ИВАН ФЕДОРОВИЧ Статья в формате PDF 352 KB...

14 10 2026 0:18:26

СОЦИАЛЬНЫЙ ХАРАКТЕР ВОПРОСОВ ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИИ

СОЦИАЛЬНЫЙ ХАРАКТЕР ВОПРОСОВ ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИИ Статья в формате PDF 100 KB...

12 10 2026 14:36:41

МИНИМИЗАЦИЯ АППАРАТУРЫ ДЛЯ ТЕРМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

МИНИМИЗАЦИЯ АППАРАТУРЫ ДЛЯ ТЕРМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Статья в формате PDF 171 KB...

08 10 2026 2:13:24

О ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ ПАРЕНТЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ В РАННЕМ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ У ПАЦИЕНТОВ ПОСЛЕ МИКРОВАСКУЛЯРНОЙ ДЕКОМПРЕССИИ КОРЕШКА ТРОЙНИЧНОГО НЕРВА

О ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ ПАРЕНТЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ В РАННЕМ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ У ПАЦИЕНТОВ ПОСЛЕ МИКРОВАСКУЛЯРНОЙ ДЕКОМПРЕССИИ КОРЕШКА ТРОЙНИЧНОГО НЕРВА Был изучен нутритивный профиль у 55 больных накануне операции микроваскулярной декомпрессии корешка тройничного нерва и в течение первых пяти суток раннего послеоперационного периода. Больные были распределены в две группы, разница в интенсивной терапии между которыми заключалась в использовании парентерального питания до того момента, когда пациент самостоятельно не начинает адекватно питаться и принимать жидкость. Изучались такие параметры, как абсолютное число лимфоцитов, уровни общего белка, альбумина и трaнcферрина плазмы крови. Было достоверно доказано положительное влияние на исходно скомпрометированный нутритивный статус проведения парентерального питания в раннем послеоперационном периоде после данной разновидности нейрохирургических вмешательств. ...

04 10 2026 5:27:35

ЭКСТРЕМАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА

ЭКСТРЕМАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА Статья в формате PDF 141 KB...

30 09 2026 21:50:31

СИСТЕМНЫЕ МОДЕЛИ ВООРУЖЕННЫХ КОНФЛИКТОВ

СИСТЕМНЫЕ МОДЕЛИ ВООРУЖЕННЫХ КОНФЛИКТОВ Статья в формате PDF 108 KB...

28 09 2026 14:42:12

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПРОДУКТЫ НА ОСНОВЕ МЯСА КРОЛИКА

Статья в формате PDF 268 KB...

26 09 2026 20:57:55

КОРРЕЛЯЦИОННЫЕ СВЯЗИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КАРДИОРЕСПИРАТОРНОЙ СИСТЕМЫ С ФИЗИЧЕСКОЙ РАБОТОСПОСОБНОСТЬЮ СПОРТСМЕНОВ МУЖСКОГО ПОЛА РАЗНОГО ВОЗРАСТА, ЗАНИМАЮЩИХСЯ РАЗЛИЧНЫМИ ВИДАМИ СПОРТА ПРИ НАГРУЗКЕ ПОВЫШАЮЩЕЙСЯ МОЩНОСТИ

КОРРЕЛЯЦИОННЫЕ СВЯЗИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КАРДИОРЕСПИРАТОРНОЙ СИСТЕМЫ С ФИЗИЧЕСКОЙ РАБОТОСПОСОБНОСТЬЮ СПОРТСМЕНОВ МУЖСКОГО ПОЛА РАЗНОГО ВОЗРАСТА, ЗАНИМАЮЩИХСЯ РАЗЛИЧНЫМИ ВИДАМИ СПОРТА ПРИ НАГРУЗКЕ ПОВЫШАЮЩЕЙСЯ МОЩНОСТИ В исследованиях приняло участие 85 спортсменов, которые были распределены 6 групп: юноши и взрослые лыжники, юноши и взрослые бегуны, юноши и взрослые спортсмены, занимающиеся скоростно-силовыми видами спорта. В качестве физической нагрузки применялась работа на велоэргометре ступенчато-повышающейся мощности без пауз отдыха от 50 до 200 Вт. При нагрузке мощностью 200 Вт во всех шести группах испытуемых выявлены значимые корреляционные связи между физической работоспособностью и частотой сердечных сокращений, отношением ударного объема крови к частоте сердечных сокращений. В группах спортсменов, занимающихся видами спорта на выносливость, и у юношей, тренирующих скоростно-силовые качества, выявлены также значимые корреляционные связи между физической работоспособностью и коэффициентом комплексной оценки обеспечения организма кислородом. ...

23 09 2026 22:42:27

Еще:
Поддержать себя -1 :: Поддержать себя -2 :: Поддержать себя -3 :: Поддержать себя -4 :: Поддержать себя -5 :: Поддержать себя -6 :: Поддержать себя -7 :: Поддержать себя -8 :: Поддержать себя -9 :: Поддержать себя -10 :: Поддержать себя -11 :: Поддержать себя -12 :: Поддержать себя -13 :: Поддержать себя -14 :: Поддержать себя -15 :: Поддержать себя -16 :: Поддержать себя -17 :: Поддержать себя -18 :: Поддержать себя -19 :: Поддержать себя -20 :: Поддержать себя -21 :: Поддержать себя -22 :: Поддержать себя -23 :: Поддержать себя -24 :: Поддержать себя -25 :: Поддержать себя -26 :: Поддержать себя -27 :: Поддержать себя -28 :: Поддержать себя -29 :: Поддержать себя -30 :: Поддержать себя -31 :: Поддержать себя -32 :: Поддержать себя -33 :: Поддержать себя -34 :: Поддержать себя -35 :: Поддержать себя -36 :: Поддержать себя -37 :: Поддержать себя -38 ::