ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Авторы
Файлы

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К⁺-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [¹⁵N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [¹⁵N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.

ЖИВОПИСНОЕ РЕШЕНИЕ ПРОСТРАНСТВА СЦЕНЫ (СВЕТО-ЦВЕТОВОЕ СОСТОЯНИЕ БАЛЕТНОГО СПЕКТАКЛЯ)

Статья в формате PDF 324 KB...

22 05 2026 17:36:30

ОПИСАТЕЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ИНФОРМАЦИОННОЙ СИСТЕМЫ «КАТАЛОГ НАУЧНЫХ ШКОЛ И ИЗОБРЕТЕНИЙ ВУЗОВ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА»

Статья в формате PDF 146 KB...

21 05 2026 12:35:47

ФОРМЫ ОРГАНИЗАЦИИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ОРИЕНТАЦИИ АБИТУРИЕНТОВ В ТЕХНИЧЕСКОМ ВУЗЕ

Статья в формате PDF 294 KB...

20 05 2026 22:38:12

СТРУКТУРА ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНЫХ СПОСОБНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА

Статья в формате PDF 149 KB...

19 05 2026 7:30:51

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ С ПОВЕРХНОСТЬЮ УГЛЕРОДОСОДЕРЖАЩИХ МАТЕРИАЛОВ

Статья в формате PDF 102 KB...

18 05 2026 17:13:24

ВЗАИМОСВЯЗЬ ДИНАМИКИ ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ С ФАКТОРАМИ ГОСПИТАЛЬНОЙ СРЕДЫ В МНОГОПРОФИЛЬНОМ ВОЕННОМ ГОСПИТАЛЕ

Статья в формате PDF 309 KB...

17 05 2026 12:14:14

МОДЕРНИЗАЦИЯ ГРОХОТА С ЭЛЕМЕНТАМИ ДИНАМИЧЕСКОГО СИНТЕЗА

В статье даны пpaктические рекомендации для проектирования вибратора грохота, который по технологическим соображениям был переведён в режим работы с повышенной частотой вращения и уменьшенной амплитудой. Разработана динамическая схема грохота и предложен алгоритм решения дифференциального уравнения. Короб грохота рассматривался как одномассная система с элементами переменной жесткости опор короба, что позволило определить требуемую возмущающую силу вибратора и величину статического момента массы дeбaлансов при заданных кинематических параметрах. На основе полученных результатов разработана рациональная конструкция дeбaлансов. ...

16 05 2026 0:37:51

ОБ УСТОЙЧИВОСТИ СОСТОЯНИЙ ЛОКАЛЬНОГО ТЕРМОДИНАМИЧЕСКОГО РАВНОВЕСИЯ РАСТВОРОВ ПРИ ФАЗОВЫХ ПЕРЕХОДАХ

Рассматриваются вопросы локального термодинамического равновесия растворов при фазовых переходах в многолетнемерзлых горных породах. Предложен способ расчета понижения температуры замерзания раствора и с учетом взаимодействия в ней ионов растворенного вещества. Получен критерий существования утойчивости термодинамического равновесия раствора при фазовых переходах. ...

15 05 2026 20:49:46

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОНЯТИЙ НАЛОГОВОГО И ФИНАНСОВОГО ПОТЕНЦИАЛА РЕГИОНА

Статья в формате PDF 118 KB...

14 05 2026 17:30:23

РОЛЬ ПСИХОФИЗИЧЕСКИХ МЕТОДОВ РЕАБИЛИТАЦИИ В ПРОФИЛАКТИКЕ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ У МАШИНИСТОВ ЛОКОМОТИВНОГО ДЕПО

Статья в формате PDF 103 KB...

13 05 2026 12:43:23

ВЛИЯНИЕ СОЛЕЙ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ПОЛ ПРИ КОМБИНИРОВАННОЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ: ИНФАРКТ МИОКАРДА И АЛЛОКСАНОВАЯ АКТИВАЦИЯ ПОЛ

Статья в формате PDF 118 KB...

12 05 2026 21:14:49

КОРРЕЛЯЦИОННЫЕ ВЗАИМОСВЯЗИ МЕЖДУ ПОКАЗАТЕЛЯМИ ГЕМОСТАЗА, ЛИПИДНОГО ОБМЕНА И КАРДИОГЕМОДИНАМИКИ У БОЛЬНЫХ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ 3 СТАДИИ, СОЧЕТАЮЩЕЙСЯ СО СТЕНОКАРДИЕЙ 3 ФУНКЦИОНАЛЬНОГО КЛАССА, ОСЛОЖНЕННОЙ ПОСТОЯННОЙ ФОРМОЙ ФИБРИЛЛЯЦИИ ПРЕДСЕРДИЙ

Статья в формате PDF 109 KB...

11 05 2026 22:58:43

Передача национального колорита при переводе текстов по туризму

Статья в формате PDF 300 KB...

10 05 2026 15:58:49

ОПТИМИЗАЦИЯ СОПРОВОЖДЕНИЯ БИЗНЕС-ПРОЦЕССОВ В СРЕДЕ 1С:ПРЕДПРИЯТИЕ

Статья в формате PDF 364 KB...

09 05 2026 11:15:22

ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕЧЕНИ ПОСЛЕ КАРДИОХИРУРГИЧЕСКИХ ВМЕШАТЕЛЬСТВ

Статья в формате PDF 125 KB...

08 05 2026 16:28:48

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ УНИВЕРСИТЕТСКИХ РЕЙТИНГОВ

Статья в формате PDF 282 KB...

07 05 2026 23:24:31

Морфофункциональные изменения Drosophilidae melanogaster в зависимости от возраста

Статья в формате PDF 122 KB...

06 05 2026 19:34:55

ПРИМЕНЕНИЕ АВТОМАТИЗИРОВАННОЙ СИСТЕМЫ ДИАГНОСТИКИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ АТЛАНТ ПРИ ОБУЧЕНИИ СТУДЕНТОВ И ПОВЫШЕНИИ КВАЛИФИКАЦИИ СПЕЦИАЛИСТОВ

Статья в формате PDF 111 KB...

05 05 2026 19:54:41

КЛАСТЕРНЫЙ АНАЛИЗ В СТРУКТУРЕ ИНФОРМАТИЗАЦИИ ДИДАКТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА

Статья в формате PDF 134 KB...

04 05 2026 17:24:45

ПОЛОВЫЕ РАЗЛИЧИЯ В ДЕНДРОАРХИТЕКТОНИКЕ НЕЙРОНОВ ЗАДНЕГО КОРТИКАЛЬНОГО ЯДРА МИНДАЛЕВИДНОГО КОМПЛЕКСА МОЗГА

Впервые с использованием метода Гольджи выявлены пoлoвые различия в дендроархитектонике нейронов заднего кортикального ядра МТ мозга пoлoвoзрелых крыс. Показано, что длинноаксонные редковетвистые нейроны у самцов имеют большее число первичных дендритов, а длинноаксонные густоветвистые нейроны обладают большей общей длиной дендритов у самок. ...

03 05 2026 1:26:46

К ВОПРОСУ ПРОТЕЗИРОВАНИЯ ПИЩЕВОДА ПЛАСТМАССОВЫМИ ТРУБКАМИ

Статья в формате PDF 121 KB...

02 05 2026 8:24:51

ВАЛЮТНЫЕ ОПЕРАЦИИ И ВАЛЮТНОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ В РФ

Статья в формате PDF 123 KB...

01 05 2026 16:48:51

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО ПРАКТИЧЕСКОЙ РЕАЛИЗАЦИИ ТЕОРИИ РЕНТНЫХ ОТНОШЕНИЙ

Статья в формате PDF 90 KB...

30 04 2026 20:38:18

ВЛИЯНИЕ СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНТОКСИКАЦИИ НА СТРУКТУРУ ПЕЧЕНИ В РАЗНЫЕ СРОКИ БЕРЕМЕННОСТИ У ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС

Статья в формате PDF 111 KB...

29 04 2026 19:42:43

И ЦЗИН КАК ИНСТРУМЕНТ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ДЛЯ РАЗВИТИЯ ЭКОНОМИЧЕСКИХ СИСТЕМ

Статья в формате PDF 117 KB...

28 04 2026 11:56:30

ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ТРАВМАТИЗМ ПРИ РЕМОНТЕ И ТЕХНИЧЕСКОМ ОБСЛУЖИВАНИИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ОБОРУДОВАНИЯ АГРОПРОМЫШЛЕННОГО КОМПЛЕКСА

Статья в формате PDF 133 KB...

27 04 2026 1:26:57

ОЦЕНКА ФОРМИРОВАНИЯ ГОТОВНОСТИ ВРАЧА К ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СИТУАЦИЯХ

Статья в формате PDF 244 KB...

26 04 2026 7:23:44

ПРЕВЕНТИВНАЯ КАДРОВАЯ ПОЛИТИКА: СОВРЕМЕННЫЕ ПЕРСОНАЛ-ТЕХНОЛОГИИ

Статья в формате PDF 275 KB...

25 04 2026 3:43:32

Фармакологическая иммунокоррекция в лечении хронического пародонтита

Статья в формате PDF 106 KB...

24 04 2026 15:42:58

ИССЛЕДОВАНИЕ СЕНСОРНОГО БАРЬЕРА В РАБОТЕ С ИЗМЕНЕННЫМИ СОСТОЯНИЯМИ СОЗНАНИЯ

Статья в формате PDF 124 KB...

23 04 2026 10:44:19

ИММУНОРЕАБИЛИТАЛОГИЯ – НОВОЕ НАПРАВЛЕНИЕ В МЕДИЦИНЕ

Статья в формате PDF 93 KB...

22 04 2026 13:40:38

Правовое регулирование защиты прав потребителей

Статья в формате PDF 113 KB...

21 04 2026 5:10:32

РОЛЬ И МЕСТО ОБЩЕСТВЕННОГО ПИТАНИЯ В СОВРЕМЕННОЙ СИСТЕМЕ ХОЗЯЙСТВОВАНИЯ

Статья в формате PDF 115 KB...

20 04 2026 14:58:41

МЕЖДУНАРОДНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ВУЗА КАК СРЕДСТВО ИНТЕРНАЦИОНАЛИЗАЦИИ ВУЗОВСКОЙ НАУКИ

Статья в формате PDF 184 KB...

19 04 2026 19:34:33

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДВУХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭЦОР (ЭЛЕКТРОННЫХ ЦИФРОВЫХ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ РЕСУРСОВ)

Статья в формате PDF 297 KB...

18 04 2026 10:20:55

К ВОПРОСУ СКРИНИНГА СПЕРМИЦИДОВ СРЕДИ ОФИЦИНАЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ С ПРОТИВОМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Перечень веществ, обладающих cпepмицидной активностью, используемых в гинекологической пpaктике в качестве местных пpoтивoзaчaточных средств, весьма ограничен. Бензалконий хлорид, мирамистин и этоний, являющиеся бисчетвертичными аммониевыми основаниями и относящиеся к катионным поверхностно-активным веществам, то есть детергентам, обладают способностью, проявляя cпepмицидную активность, оказывать выраженное антимикробное действие. Известен в качестве cпepмицида с сочетанной антимикробной активностью ноноксинол-9. Антисептическое средство метиленовый синий – метилметионин-сульфоний хлорид – также имеет в своей структуре атом четвертичного азота и согласно литературным данным обладает cпepмицидным действием. Проведённые эксперименты по определению cпepмицидной активности антимикробных соединений позволяют предположить, что установление факта принадлежности вещества к четвертичным аммониевым основаниям априори предполагает их cпepмицидную активность и возможность применения в качестве местных пpoтивoзaчaточных средств с сочетанной антимикробной активностью. ...

17 04 2026 18:39:50

РЕГИОНАЛЬНЫЕ ТРАНСФОРМАЦИИ В ЗАНЯТОСТИ НАСЕЛЕНИЯ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ ПРИ ПЕРЕХОДЕ К РЫНКУ

Статья в формате PDF 142 KB...

16 04 2026 22:13:45

ПОВЫШЕНИЕ СТОЙКОСТИ РЕЖУЩЕГО ИНСТРУМЕНТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МНОГОСЛОЙНЫХ ПОКРЫТИЙ

Статья в формате PDF 255 KB...

15 04 2026 14:18:15

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ СТАТУС СИСТЕМЫ КРОВИ В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ СЕРОСОДЕРЖАЩИХ ПОЛЛЮТАНТОВ

Статья в формате PDF 112 KB...

14 04 2026 19:37:30

ПРЯМОЙ МЕТОД ЛЯПУНОВА ДЛЯ ГИПЕРБОЛИЧЕСКОЙ СМЕШАННОЙ ЗАДАЧИ НА ПЛОСКОСТИ

Статья в формате PDF 121 KB...

13 04 2026 8:11:46