ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Авторы
Файлы

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К⁺-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [¹⁵N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [¹⁵N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ДОПЕГИТА НА ПОКАЗАТЕЛИ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ И ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ У БЕРЕМЕННЫХ С ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ

Статья в формате PDF 109 KB...

12 04 2026 3:48:17

БИОТЕХНИЧЕСКИЙ ЗАКОН И СОДЕРЖАТЕЛЬНАЯ АДЕКВАТНОСТЬ МОДЕЛИ

Статья в формате PDF 200 KB...

11 04 2026 4:32:15

ФЕРРОГЛЮКИН И ГАМАВИТ В КОРРЕКЦИИ АНТИАГРЕГАЦИОННЫХ СВОЙСТВ СОСУДОВ У НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛЯТ С ДЕФИЦИТОМ ЖЕЛЕЗА

Статья в формате PDF 241 KB...

10 04 2026 1:13:27

ГИБКОЕ УПРАВЛЕНИЕ ПРОЦЕССАМИ КОАГУЛЯЦИИ ВОДЫ

Статья в формате PDF 104 KB...

09 04 2026 9:56:43

АВТОМАТИЗАЦИЯ УПРАВЛЕНЧЕСКОГО УЧЕТА И БЮДЖЕТИРОВАНИЯ

Статья в формате PDF 220 KB...

08 04 2026 11:50:29

КОМПЛЕКСНАЯ ПЕРЕРАБОТКА ДРЕВЕСНОГО СЫРЬЯ. УТИЛИЗАЦИЯ ДРЕВЕСНЫХ ОТХОДОВ

Статья в формате PDF 269 KB...

07 04 2026 14:55:58

ПЕТРОЛОГИЯ ПОРОДНЫХ ТИПОВ И ГЕНЕЗИС БОРОВЛЯНСКОГО КОМПЛЕКСА ГОРНОГО АЛТАЯ

Приведены данные по петрографии, петрологии, геохимии и генезису магматитов боровлянского комплекса Горного Алтая. Гранитоиды отнесены к пералюминиевому I – типу Sr – не деплетиованному, Y – деплетированному. Расплавы для пород боровлянского комплекса образовались в результате мантийно-корового взаимодействия со значительной модификацией мантийной составляющей путём контаминации расплавов из нижней коры. Такие расплавы могут возникать в результате термальной релаксации в нижней коре с плавлением кварцевых эклогитов и гранатовых амфиболитов LIL – обогащённого мантийного клина, а мантийно-производные компоненты – в результате адиабатической декомпрессии в верхней мантии с участием большого количества летучих компонентов. ...

06 04 2026 10:35:59

Влияние аутсорсинга на развитие международного бизнеса

Статья в формате PDF 294 KB...

05 04 2026 6:20:15

ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ УЧЕТНО-АНАЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В СТРОИТЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗАЦИЯХ

Статья в формате PDF 130 KB...

04 04 2026 15:57:57

СЕТЕВЫЕ МЕТОДЫ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧИ КОММИВОЯЖЁРА

Статья в формате PDF 423 KB...

03 04 2026 19:19:43

Роль системы планирования в деятельности лесопромышленного предприятия

Статья в формате PDF 292 KB...

02 04 2026 0:56:49

АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ КЛИНИЧЕСКОГО МЫШЛЕНИЯ И СОВРЕМЕННОСТЬ

Статья в формате PDF 105 KB...

01 04 2026 20:21:10

Взаимодействие экономики и экологии в техносфере

Статья в формате PDF 254 KB...

31 03 2026 11:51:52

НОВАЯ СОЦИАЛЬНО-ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ И МЕДИЦИНСКАЯ ПРОБЛЕМА ОБЩЕСТВА – КОМПЬЮТЕРНЫЙ ЗРИТЕЛЬНЫЙ СИНДРОМ

Статья в формате PDF 112 KB...

30 03 2026 18:38:58

К ВОПРОСУ АВТОМАТИЗИРОВАННОЙ ДИАГНОСТИКИ РИСКА РОЖДЕНИЯ БОЛЬНОГО РЕБЕНКА В ПРОЦЕССЕ РЕФЛЕКСОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Статья в формате PDF 149 KB...

29 03 2026 3:59:27

АЛГОРИТМ МАКСИМИЗАЦИИ ФУНКЦИИ ОЦЕНКИ СЕМАНТИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ СТРОКОВОГО ШАБЛОНА

Статья в формате PDF 113 KB...

28 03 2026 13:24:23

ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ОБЩЕЙ НОЗОЛОГИИ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПОГРАНИЧНЫХ СОСТОЯНИЙ

Статья в формате PDF 120 KB...

27 03 2026 17:59:32

ФОРМИРОВАНИЕ В РОССИЙСКИХ СТРОИТЕЛЬНЫХ КОМПАНИЯХ ЦЕНТРОВ КАПИТАЛОВЛОЖЕНИЙ

Статья в формате PDF 156 KB...

26 03 2026 5:15:24

КОНФОРМАЦИОННАЯ ИЗОМЕРИЗАЦИЯ МЕТИЛБОРНОЙ КИСЛОТЫ

Статья в формате PDF 127 KB...

25 03 2026 21:50:11

ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О ЛИЧНОСТНОМ ВЫБОРЕ И ЕГО РОЛИ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ЛИЧНОСТИ С ТОЧКИ ЗРЕНИя ЭКЗИСТЕНЦИАЛЬНОГУМАНИСТИЧЕСКОГО ПОДХОДА К ИЗУЧЕНИЮ ЛИЧНОСТИ

Статья в формате PDF 300 KB...

24 03 2026 18:37:58

КОБАЛЬТ-НИКЕЛЕВЫЕ АРСЕНИДНЫЕ РУДЫ И ПРОБЛЕМЫ БИОЭКОЛОГИИ

Статья в формате PDF 140 KB...

23 03 2026 8:30:51

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ВВЕДЕНИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВАКЦИН ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫМ ДЕТЯМ

Статья в формате PDF 276 KB...

22 03 2026 18:31:52

ОЦЕНКА ГИДРОХИМИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ВОДНЫХ РЕСУРСОВ УГЛЕДОБЫВАЮЩЕГО КОМПЛЕКСА ЮЖНОЙ ЯКУТИИ

Проведена работа по полевому и лабораторному изучению современного гидрохимического состояния воды и донных отложений рек зоны воздействия угледобывающего промышленного комплекса Южной Якутии. На основе анализа результатов исследований дана оценка качества данных водотоков. Установлено загрязнение нормируемого содержания некоторых компонентов воды естественного и техногенного хаpaктера. ...