ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Авторы
Файлы

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К⁺-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [¹⁵N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [¹⁵N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.

Глобальный инновационный индекс: относительные показатели рейтинга стран

Приведены закономерности рангового распределения по рейтингу 110 стран, среди них Россия занимала 49-е место. Для анализа были приняты показатели: 1) инновационные затраты/суммарный балл; 2) инновационная эффективность/суммарный балл); 3) инновационная эффективность/инновационные затраты. Сравнение показывает весьма скромную инновационную активность России, но при этом значения всех трех относительных показателей инновационной активности у России положительные или позитивные. Только изобретения имеют мировую новизну и достаточно высокую конкурентоспособность, а полезные модели нужны в основном для внутреннего употрeбления. В итоге в стране образуется так называемый инновационный крест. Динамика изобретений куда значимее, если при этом снизить справедливое в неспокойной экономике колебательное возмущение изобретателей. ...

12 06 2026 2:43:26

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ХИМИОПРОФИЛАКТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Статья в формате PDF 118 KB...

11 06 2026 15:27:20

Возрастные изменения минерального состава костной ткани у женщин Карелии

Статья в формате PDF 102 KB...

10 06 2026 23:37:15

РИСКИ В ЛЕСНОЙ ОТРАСЛИ

Статья в формате PDF 269 KB...

09 06 2026 3:53:49

ЭНЕРГОСБЕРЕГАЮЩИЕ ТЕХНОЛОГИИ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ КАК ВАЖНЫЙ ЭТАП РАЗВИТИЯ СОВРЕМЕННОГО ЗЕМЛЕДЕЛИЯ

Статья в формате PDF 147 KB...

08 06 2026 4:32:56

ВОДА – НОСИТЕЛЬ ИНФОРМАЦИИ В ВОЛНОВОЙ ГЕНЕТИКЕ

Статья в формате PDF 101 KB...

07 06 2026 4:58:44

РАЗВИТИЕ ТВОРЧЕСКОЙ ЛИЧНОСТИ ВО ВНЕШКОЛЬНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ

Статья в формате PDF 256 KB...

06 06 2026 17:49:17

ИННОВАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ФОРМИРОВАНИЯ НАВЫКОВ ЗДОРОВОГО ОБРАЗА ЖИЗНИ УЧАЩИХСЯ СЕЛЬСКИХ ШКОЛ ВО ВНЕКЛАССНОЙ РАБОТЕ

В этой статье рассматриваются вопросы применения инновационных технологии формирования навыков здорового образа жизни учащихся сельских школ во внеурочное время. ...

05 06 2026 4:43:27

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ УПРАВЛЕНИЯ РЕКРЕАЦИОННЫМ ПОТЕНЦИАЛОМ ОТРАСЛЕЙ СФЕРЫ УСЛУГ: ТЕОРЕТИКО-МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТ

Статья в формате PDF 100 KB...

04 06 2026 12:30:54

В НАЧАЛЕ ЕСТЕСТВЕННОНАУЧНОГО ПОИСКА

Задачу формирования интеллекта учащихся призвана решать современная школа и, в первую очередь, учебные заведения с названиями «лицей» и «гимназия». В представленной работе излагаются сведения об основных этапах по подготовке и проведению школьной научно-пpaктической конференции «В науку первые шаги», которая ежегодно проводится в Лицее № 37 г. Саратова. В рамках конференции каждый учащийся 11 класса защищает выпускную работу по профильному предмету (математике, физике, информатике, химии, биологии и др.). Подготовка к защите выпускной или творческой работы по химии способствует личностно-ориентированному обучению и воспитанию школьников, развитию активности и самостоятельности, учит работать с библиографической и информационно-справочной литературой, пользоваться электронными каталогами через систему Internet, знакомит с историей науки, развивает экспериментальные навыки, обучает целенаправленным наблюдениям. ...

03 06 2026 18:13:46

ПЛАН НАУЧНЫХ КОНФЕРЕНЦИЙ РАЕ

Статья в формате PDF 122 KB...

02 06 2026 2:15:10

РОЛЬ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ МЕТОДОВ В ПРОЦЕССЕ ОБУЧЕНИЯ РУССКОМУ ЯЗЫКУ

Статья в формате PDF 107 KB...

01 06 2026 14:52:57

РАЗВИТИЕ МОТИВАЦИИ СТУДЕНТОВ КАК СРЕДСТВО ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА ОБУЧЕНИЯ ИНОСТРАННЫМ ЯЗЫКАМ

Статья в формате PDF 106 KB...

31 05 2026 6:47:13

Опиоидные пептиды как модуляторы гумopaльного иммунного ответа при экспериментальной ожоговой травме

Статья в формате PDF 115 KB...

30 05 2026 7:48:30

УСТАНОВКА ДЛЯ ОЧИСТКИ СМАЗОЧНО-ОХЛАЖДАЮЩИХ ЖИДКОСТЕЙ ОТ ФЕРРОМАГНИТНЫХ ЧАСТИЦ

Статья в формате PDF 359 KB...

29 05 2026 0:14:37

МИКРОБНЫЙ ПЕЙЗАЖ КАЛИНИНГРАДСКОГО ЗАЛИВА И ЕГО ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА

Статья в формате PDF 131 KB...

28 05 2026 21:42:21

ВЛИЯНИЕ ПРЕРЫВИСТОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ НА МИКРОГЕМОЦЕРКУЛЯТОРНОЕ РУСЛО ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Статья в формате PDF 127 KB...

27 05 2026 17:46:47

СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ МИРОВОГО ХОЗЯЙСТВА

Статья в формате PDF 298 KB...

26 05 2026 18:12:18

ПРИОРИТЕТНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ СОЗДАНИЯ РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩИХ ТЕХНОЛОГИЙ ЗАЩИТЫ САДОВ ОТ ВРЕДИТЕЛЕЙ

Статья в формате PDF 114 KB...

25 05 2026 16:56:23

УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕДПРИЯТИЕМ ОАО «УРАЛОРГСИНТЕЗ»

Статья в формате PDF 106 KB...

24 05 2026 6:45:29

ЗАНЯТОСТЬ ЖЕНЩИН ИННОВАЦИОННОГО ТИПА: ТЕОРИЯ, МЕТОДОЛОГИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ, УПРАВЛЕНИЕ

Статья в формате PDF 279 KB...

23 05 2026 1:24:49

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОСНОВНЫХ ТИПОВ НЕЙРОНОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО ОТДЕЛА МИНДАЛЕВИДНОГО КОМПЛЕКСА МОЗГА

Статья в формате PDF 110 KB...

22 05 2026 5:50:48

ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ФИНАНСОВЫХ ВЛОЖЕНИЙ В ОБЪЕКТЫ ЭЛЕКТРОЭНЕРГЕТИКИ

Статья в формате PDF 335 KB...

21 05 2026 0:58:15

БИОТЕХНИЧЕСКИЙ ЗАКОН И ПОДГОТОВКА ИСХОДНЫХ ДАННЫХ

Статья в формате PDF 249 KB...

20 05 2026 22:15:21

ДЕСТРУКТИВНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СИНАПСОВ В ПЕРЕДНИХ РОГАХ СЕРОГО ВЕЩЕСТВА СПИННОГО МОЗГА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ, С ПРЕДШЕСТВУЮЩИМ ПРИМЕНЕНИЕМ ДВИГАТЕЛЬНОЙ НАГРУЗКИ

Статья в формате PDF 109 KB...

19 05 2026 23:48:27

КЛИНИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ИНСУЛИНОРЕЗИСТЕНТНОСТИ И КОМПОНЕНТОВ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА

В статье постовариоэктомический синдром рассматривается как предиктор метаболического синдрома у женщин различных возрастных групп. На результатах анализа разнообразного клинико-диагностического материала показано, что женщин с постовариоэктомическим синдромом в возрасте после 40 лет достоверно чаще наблюдаются метаболические нарушения. ...

18 05 2026 6:13:58

ИНТЕГРАЛЫ: КРАТНЫЕ, КРИВОЛИНЕЙНЫЕ И ТРОЙНЫЕ

Статья в формате PDF 266 KB...

17 05 2026 21:43:52

РОЛЬ ИНФОРМАЦИОННЫХ ПЕДАГОГИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ В УЧЕБНОМ ПРОЦЕССЕ

Статья в формате PDF 358 KB...

16 05 2026 3:29:55

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ МЕЛОКСИКАМА ДЛЯ НАРУЖНОГО ПРИМЕНЕНИЯ

При выборе рациональной технологии изготовления и оптимизации составов мазей и гелей с нестероидным противовоспалительным средством – мелоксикамом (МК) важно изучение реологических свойств данных лекарственных форм (ЛФ). Статья посвящена изучению реологических свойств мазей и гелей МК. Исследования, проведенные авторами, позволили определить факторы, влияющие на реологические свойства изучаемых ЛФ МК и охаpaктеризовать исследуемые образцы мазей и гелей МК, как структурированные дисперсные системы. ...

15 05 2026 7:11:49

ТЕТРАДНЫЙ ЭФФЕКТ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ РЕДКОЗЕМЕЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В РЕШЕНИИ ПРОБЛЕМ ПЕТРОЛОГИИ ГРАНИТОИДОВ

Рассмотрены химические и термодинамические особенности возникновения тетрадного эффекта фpaкционирования редкоземельных элементов в высоко эволюционированных гранитоидах на многих примерах его проявления в отечественной и зарубежной пpaктики. Выявление тетрадного эффекта позволяет боле глубоко понять особенности петрологии развития магматических очагов многих интрузивных комплексов и потенциальные перспективы гранитоидов на редкометалльное и редкоземельное оруденение. Составлена математическая программа расчёта тетрадного эффекта фpaкционирования редкоземельных элементов, прилагаемая в электронном варианте к статье. ...