ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Авторы
Файлы

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К⁺-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [¹⁵N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [¹⁵N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.

Исследование процесса ферментации творожной сыворотки

Статья в формате PDF 121 KB...

02 07 2026 13:45:48

АНАТОМИЯ ЭМОЦИОНАЛЬНОГО МОЗГА

Статья в формате PDF 153 KB...

01 07 2026 23:26:15

Активность реакций перекисного окисления липидов и содержание антиоксидантов в крови у женщин с воспалительными и опухолевыми заболеваниями яичников

Статья в формате PDF 127 KB...

30 06 2026 2:19:35

ПРОФЕССИОНАЛЬНАЯ НАПРАВЛЕННОСТЬ РАСЧЕТНЫХ ЗАДАЧ ПО ФИЗИЧЕСКОЙ И КОЛЛОИДНОЙ ХИМИИ ДЛЯ СТУДЕНТОВ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТА

Статья в формате PDF 133 KB...

29 06 2026 9:19:17

ДИСКРЕТНО-КОНТИНУАЛЬНЫЙ ДУАЛИЗМ БЫТИЙНО-НЕБЫТИЙНОГО МИРА

Статья в формате PDF 121 KB...

28 06 2026 23:27:43

МЕТОДИКА СИНТЕЗА ГЕОМЕТРИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ УДАРНЫХ СИСТЕМ

Статья в формате PDF 254 KB...

27 06 2026 18:32:35

ПЕДАГОГИКА ЗДОРОВЬЯ: ОБУЧЕНИЕ ДЕТЕЙ НАВЫКАМ ОСОЗНАННОЙ САМОРЕГУЛЯЦИИ ПРОИЗВОЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ

Статья в формате PDF 269 KB...

26 06 2026 5:57:57

К ВОПРОСУ О РАЦИОНАЛИЗАЦИИ УПРАВЛЕНИЯ МУНИЦИПАЛЬНЫМ БОЛЬНИЧНО-ПОЛИКЛИНИЧЕСКИМ КОМПЛЕКСОМ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ МАРКЕТИНГОВОГО АНАЛИЗА И ПРОГНОСТИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ ЕГО ДЕЯТЕЛЬНОСТИ

Статья в формате PDF 133 KB...

25 06 2026 17:49:45

ЦИКЛИЧНОСТЬ И АСИНХРОННОСТЬ СТРУКТУРНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ПОДЧЕЛЮСТНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА

Статья в формате PDF 242 KB...

24 06 2026 1:47:28

АВТОРИТЕТ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ-ВРАЧА

Статья в формате PDF 94 KB...

23 06 2026 0:15:16

ПЕДИАТРИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ПИЩЕВОГО СТАТУСА ЖЕНЩИН

В работе освещены современные представления о питании беременных женщин. Описаны возможные осложнения при нарушении пищевого статуса перед вступлением в бpaк. Показаны пути коррекции питания беременных женщин в первые периоды беременности, которые используются в России и в развитых западных странах. ...

22 06 2026 8:26:46

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ХЛЕБА, ОБОГАЩЕННОГО СЕМЕНАМИ НУТА

Статья посвящена экспериментальному исследованию по разработке технологии приготовления хлеба повышенной биологической ценности на основе биоактивированных семян нута. В ходе исследований были определены рациональные режимы проращивания семян нута, исследованы их химический состав и ферментативная активность; разработана технология хлебобулочных изделий на основе измельченных биоактивированных семян нута; составлен аппаратурно-технологический участок приготовления теста. ...

21 06 2026 21:33:22

КОНКУРЕНТОСПОСОБНОСТЬ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ УЧРЕЖДЕНИЙ: КЛЮЧЕВЫЕ ФАКТОРЫ УСПЕХА

Статья в формате PDF 111 KB...

20 06 2026 17:20:33

СОСТАВЛЕНИЕ И РЕШЕНИЕ УРАВНЕНИЙ ЛАГРАНЖА I РОДА

Статья в формате PDF 834 KB...

19 06 2026 1:21:40

КОНТАКТНАЯ АКТИВАЦИЯ АРТЕРИАЛЬНОЙ КРОВИ

Статья в формате PDF 118 KB...

18 06 2026 18:43:48

МОДУЛЯРНЫЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ В ВЕЙВЛЕТ-ОБРАБОТКЕ РЕЧЕВЫХ СИГНАЛОВ

Статья в формате PDF 186 KB...

17 06 2026 13:53:38

Эколого-экономические проблемы сохранения водных биоресурсов Каспийского моря

Статья в формате PDF 117 KB...

16 06 2026 21:51:15

К ВОПРОСУ О ФОРМИРОВАНИИ ЕДИНОГО НАУЧНОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОСТРАНСТВА

Статья в формате PDF 269 KB...

15 06 2026 6:48:13

KON-OM-КОРРЕКЦИЯ КАК МЕТОД ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПРИ СТРЕССОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ

Статья в формате PDF 209 KB...

14 06 2026 21:52:11

О ПОНЯТИИ «ПРОФЕССИОНАЛЬНАЯ КОМПЕТЕНТНОСТЬ» В СОВРЕМЕННОЙ ПЕДАГОГИЧЕСКОЙ НАУКЕ

Статья в формате PDF 259 KB...

13 06 2026 10:16:51

Исследование психической нагрузки в валеологических аспектах здоровья

Статья в формате PDF 127 KB...

12 06 2026 13:21:18

УПРАВЛЕНИЕ АДАПТИВНЫМИ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫМИ СИСТЕМАМИ

Статья в формате PDF 124 KB...

11 06 2026 4:53:41

ЗАМЕЩЕНИЕ ИМПОРТНЫХ ПОТОКОВ ЩЕЛОЧНОГО БЕНТОНИТА В РОССИИ

Статья в формате PDF 113 KB...

10 06 2026 22:11:53

ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПРОФОРИЕНТАЦИОННОЙ РАБОТЫ В ОБРАЗОВАТЕЛЬНОМ ПРОЦЕССЕ

Статья в формате PDF 242 KB...

09 06 2026 5:40:11

ВАРИАНТЫ ПОСТАВКИ СПЕЦТЕХНИКИ ДЛЯ МАЛЫХ ПРЕДПРИЯТИЙ ГОРОДА КОМСОМОЛЬСКА-НА-АМУРЕ

Статья в формате PDF 255 KB...

08 06 2026 5:44:49

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОПУСТИМЫХ УРОВНЕЙ АНТРОПОГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ С ПОЗИЦИЙ ГЕОЭКОНОМИКИ

Статья в формате PDF 125 KB...

07 06 2026 9:36:50

КЛИНИКО-СОЦИАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЖЕНЩИН, УПОТРЕБЛЯВШИХ ВО ВРЕМЯ БЕРЕМЕННОСТИ АЛКОГОЛЬ

Статья в формате PDF 105 KB...

06 06 2026 18:35:56

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПИТЬЕВОГО ВОДОСНАБЖЕНИЯ АСТРАХАНСКОГО ГАЗОКОНДЕНСАТНОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ И г. АСТРАХАНИ

Статья в формате PDF 141 KB...

05 06 2026 7:21:32

Липиды плазмы крови животных с эндотоксемией как модификаторы активности ферментов in vitro

Статья в формате PDF 104 KB...

04 06 2026 8:11:51

ПЕДАГОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ КОМПЬЮТЕРНОЙ ЗАВИСИМОСТИ У ПОДРОСТКОВ-ВОСПИТАННИКОВ ПРИЮТА

Статья в формате PDF 276 KB...

03 06 2026 16:38:43

РИСКИ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ИСХОДОВ БЕРЕМЕННОСТИ И НАРУШЕНИЙ ЗДОРОВЬЯ НОВОРОЖДЕННЫХ В УСЛОВИЯХ ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА

Статья в формате PDF 309 KB...

02 06 2026 6:53:36

ЧИСЛЕННОЕ РЕШЕНИЕ УРАВНЕНИЯ ДИССИПАЦИИ ЭНЕРГИИ В ПОГРАНИЧНОМ СЛОЕ АТМОСФЕРЫ

Статья в формате PDF 210 KB...

01 06 2026 12:53:52

Третий этап обращения куфического дирхема и расцвет Волховско-Ильменского денежного рынка (770-780-е гг.)

Статья в формате PDF 264 KB...

31 05 2026 22:42:50

КОМПЛЕКСНОЕ ПОВЫШЕНИЕ ЭКСПЛУАТАЦИОННЫХ СВОЙСТВ НИЗКОЛЕГИРОВАННОЙ СТАЛИ ПУТЕМ ОБЪЕМНОГО НАНОСТРУКТУРИРОВАНИЯ

Статья в формате PDF 251 KB...

30 05 2026 15:32:52

АНАЛИЗ ИННОВАЦИОННОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ВУЗОВ РОССИИ

Статья в формате PDF 315 KB...

29 05 2026 13:19:56

РОЛЬ ТРОМБОЦИТОВ В РАЗВИТИИ ГЕМОСТАЗИОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ У БОЛЬНЫХ Β1+Α-АДРЕНОЗАВИСИМЫМ ТИПОМ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ

Статья в формате PDF 115 KB...

28 05 2026 5:36:47

ПРИНИП ДОПОЛНИТЕЛЬНОСТИ, КАК ЕСТЕСТВЕННОНАУЧНОЕ И ПЕДАГОГИЧЕСКОЕ ПОНЯТИЕ

Статья в формате PDF 90 KB...

27 05 2026 2:49:20

ОЦЕНКА КОНСТРУКТИВНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ОБЩЕСТВЕННО ВАЖНЫХ ЗДАНИЙ ГЕОФИЗИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

Статья в формате PDF 300 KB...

26 05 2026 15:58:28

ПРИНЦИПЫ ТЕОРИИ КОНТЕЙНЕРОВ В ПРИМЕНЕНИИ К СОЗДАНИЮ ГИБКИХ ПРОГРАММНЫХ СИСТЕМ

Статья в формате PDF 103 KB...

25 05 2026 3:29:55

ВЛИЯНИЕ ГУСТОТЫ СТОЯНИЯ НА НАКОПЛЕНИЕ САХАРОВ В СОКЕ СТЕБЛЕЙ САХАРНОГО СОРГО В УСЛОВИЯХ АРИДНОЙ ЗОНЫ

Изучено влияние различной густоты стояния сахарного сорго на накопление сахаров в соке стeблей, сортов Юбилейное и Славянское поле ВС, в аридной зоне на различных типах почв. Установлено, что тип почвы дает незначительную прибавку в накоплении сахаров, но существенное влияние оказывает норма посева. Наибольшее накопления сахаров 12,6 т/га отмечено у сорта Славянское поле ВС при норме посева 100 тыс. шт. растений на 1 га. С увеличением нормы посева до 160 тыс. шт. на 1/га содержание сахаров в соке стeблей уменьшалось. ...

24 05 2026 5:36:14