ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Авторы
Файлы

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К⁺-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [¹⁵N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [¹⁵N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.

Анализ АТФ-зависимых и кальциевых механизмов в реализации нейротропного действия аспирина и его производных

Статья посвящена исследованию механизмов нейротропного действия аспирина, ацетилсалицилатов кобальта и цинка. Показано, что наличие аденозинтрифосфата во внеклеточном прострaнcтве существенно модифицирует нейротропные эффекты салицилатов. Сочетанное приложение аденозинтрифосфата с аспирином устраняет угнетение импульсной активности нейронов, вызванное индивидуальным раствором этого препарата, а совместная экспозиция аденозинтрифосфата с ацетилсалицилатами кобальта и цинка, наоборот, усиливает их активирующие эффекты. При блокировании CdCl2 и BaCl2 поступления Са2 + в нейроплазму из внеклеточной среды и внутриклеточных депо выявлено, что кальциевые механизмы не участвуют в нейротропных эффектах исследуемых салицилатов. ...

23 03 2026 18:38:59

ВОЗДЕЙСТВИЕ АГРОПРОМЫШЛЕННОГО КОМПЛЕКСА НА ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУ

Статья в формате PDF 110 KB...

22 03 2026 4:55:33

ВЛИЯНИЕ ОСТРОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ НА ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

Статья в формате PDF 138 KB...

21 03 2026 10:32:41

СКОРОСТНОЕ ФОРМООБРАЗОВАНИЕ МЕТАЛЛА

Статья в формате PDF 138 KB...

20 03 2026 20:32:24

ПРОБЛЕМА ДУХОВНОГО ОПЫТА ЧЕЛОВЕКА В КОНТЕКСТЕ РЕФЛЕКСИВНОГО АНАЛИЗА

В данной статье раскрывается содержание таких понятий, как духовность и религиозность. Анализ названных понятий проходит в контексте рассмотрения самопознания в качестве особого вида деятельности человека. Автором также предлагаются критерии, согласно которым человек может определять степень развития своего сознания. ...

19 03 2026 19:49:44

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ УПРАВЛЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВОМ, ПРОБЛЕМЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ И КОНТРОЛЯ

Статья в формате PDF 276 KB...

18 03 2026 23:34:58

ОСОБЕННОСТИ ПЕРЕВОДЧЕСКИХ ПРЕОБРАЗОВАНИЙ В ДИАХРОНИЧЕСКОМ ПЕРЕВОДЕ (НА МАТЕРИАЛЕ ТЕКСТОВ СРЕДНЕАНГЛИЙСКОГО И РАННЕНОВОАНГЛИЙСКОГО ПЕРИОДОВ)

Статья в формате PDF 303 KB...

17 03 2026 14:21:24

Развивитие функционально-графической грамотности в основной школе

Статья в формате PDF 249 KB...

16 03 2026 14:30:57

Структурные особенности лимфангионов некоторых органов пищеварительной системы овцы в постнатальном онтогенезе

Статья в формате PDF 120 KB...

15 03 2026 14:35:20

ОРГАНИЗАЦИОННОЕ ПОВЕДЕНИЕ И ЭКОНОМИЧЕСКОЕ СОЗНАНИЕ

Статья в формате PDF 98 KB...

14 03 2026 18:22:31

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ РАСТВОРИМОСТИ СУЛЬФИДОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА ПРИМЕРЕ МЕДИ И СВИНЦА

Статья в формате PDF 107 KB...

13 03 2026 4:43:17

РАБОТА РАДИАЛЬНОГО НАГНЕТАТЕЛЯ НА ТРУБОПРОВОДНУЮ СЕТЬ (учебное пособие)

Статья в формате PDF 97 KB...

12 03 2026 18:41:51

ВОЗМОЖНОСТИ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ОПОРНО-ДВИГАТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ ИНФРАКРАСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ПЛАЗМЫ КРОВИ

Целью исследования является оценка возможности ранней дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей опopно-двигательной системы с помощью инфpaкрасной спектроскопии плазмы крови. При этом бралась венозная кровь из локтевой вены у контрольной группы пациентов с заранее установленным диагнозом существующими методами, после чего выделялась плазма. Исследуемая плазма крови помещалась в жидкостную кювету. Спустя 1,5-2 часа исследуемая кювета помещалась в ИК–Фурье- спектрометр. Снимался спектр пропускания плазма крови. Вычислялся коэффициент пропускания по данным снятых спектров. Затем рассчитывались коэффициенты объемного поглощения. В процессе экспериментов нами был вычислен статистически значимый уровень β = 700 см–1, ниже которого находились значения, соответствующие доброкачественным опухолям, выше- злокачественным опухолям. ...

11 03 2026 12:45:10

УПРОЧНЕНИЕ ПРЕСС–ФОРМ МЕТОДОМ ЛАЗЕРНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

Статья в формате PDF 265 KB...

10 03 2026 20:22:15

ПРОБЛЕМА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЧИСТОТЫ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ МЯГКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ

Статья в формате PDF 105 KB...

09 03 2026 8:24:29

ЭКОЗАЩИТА ПОЧВ

Статья в формате PDF 105 KB...

08 03 2026 8:50:25

СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ НАУКИ И ОБРАЗОВАНИЯ

Статья в формате PDF 106 KB...

07 03 2026 5:27:42

ПОДХОДЫ ИНФОРМАЦИОННОЙ ПОДДЕРЖКИ СОТРУДНИКОВ ОТДЕЛА ТЕХНИЧЕСКОГО ОБСЛУЖИВАНИЯ КОМПЬЮТЕРОВ

Статья в формате PDF 456 KB...

06 03 2026 20:11:14

ОТХОДЫ ПРОИЗВОДСТВА ОАО «ТЕРНЕЙЛЕС» (ПРИМОРСКИЙ КРАЙ) И ПРОБЛЕМЫ ИХ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ

Статья в формате PDF 205 KB...

05 03 2026 5:39:23

ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА В ИВАНОВСКОЙ ОБЛАСТИ

Статья в формате PDF 118 KB...

04 03 2026 18:15:31

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ТКАНЕЙ ПРОМЫСЛОВЫХ РЫБ СЕВЕРНОГО БАССЕЙНА

Статья в формате PDF 109 KB...

03 03 2026 16:44:33

ЭЛЕКТРОМАГНИТНОЕ ПОЛЕ КАК ПРИЧИНА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Статья в формате PDF 119 KB...

02 03 2026 3:32:27

НЕЗАКОННАЯ РУБКА ЛЕСА И НЕЛЕГАЛЬНЫЙ ОБОРОТ ДРЕВЕСИНЫ В РФ: ОСНОВНЫЕ ПРИЧИНЫ И МЕРЫ ПО ОБЕСПЕЧЕНИЮ БОРЬБЫ С НИМИ

Статья в формате PDF 297 KB...

01 03 2026 17:44:49

УРОВЕНЬ И ХАРАКТЕР СОЧЕТАННОСТИ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ БОЛЕЗНЕЙ

Статья в формате PDF 82 KB...

28 02 2026 3:53:13

ПОКАЗАТЕЛИ АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ОТЕЧЕСТВЕННОГО ИММУНОМОДУЛЯТОРА «ТАМЕРИТА» В МОДЕЛЬНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ

Статья в формате PDF 106 KB...

27 02 2026 4:39:54

КОРРЕКЦИЯ ЦИТОФЛАВИНОМ «ЦИТОЛИТИЧЕСКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ» ПОРАЖЕНИЙ ПЕЧЕНИ

Статья в формате PDF 105 KB...

26 02 2026 15:44:21

ИНТЕГРАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ И КАЧЕСТВА ПРИРОДНОЙ И АНТРОПОГЕННО-ТРАНСФОРМИРОВАННОЙ СРЕДЫ

Статья в формате PDF 103 KB...

25 02 2026 7:38:30

РЕАЛИЗАЦИЯ РАДИОЭЛЕКТРОННОЙ АППАРАТУРЫ НА ОСНОВЕ АНАЛОГО-ЦИФРОВЫХ БАЗОВЫХ МАТРИЧНЫХ КРИСТАЛЛОВ

Статья в формате PDF 140 KB...

24 02 2026 8:36:44

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА ТЕХНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ КОНТРОЛЯ ГИДРАВЛИЧЕСКИХ СОПРОТИВЛЕНИЙ КАНАЛОВ

Статья в формате PDF 152 KB...

23 02 2026 6:26:33

ПЛАЦЕНТАРНАЯ ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА – МАРКЕР ЭМБРИОНАЛЬНЫХ И МАЛИГНИЗИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ

Плацентарную щелочную фосфатазу (ПЩФ) относят к белкам, ассоциированным с беременностью и опухолевым ростом. ПЩФ образуется в плаценте и фетальных тканях, в крови беременных женщин выявляется с 10–14 недель в количестве от 1,0 до 40,0 Ед/л, сохраняясь в кровотоке после родов в течение 10–14 дней. ПЩФ является маркёром герминогенных опухолей, обнаруживается в биологических жидкостях, эпителиальных клетках, фибробластах стромы и эндотелии новообразующихся сосудов опухолевой ткани при paке лёгкого и других органов, что следует учитывать при назначении лечения. ...