ПОЛУЧЕНИЕ СЕЛЕКТИВНО-МЕЧЕНОГО ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА ПОТЕНЦИАЛОЗАВИСИМОГО ИОННОГО КАНАЛА KVAP В БАКТЕРИАЛЬНОЙ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ

Авторы
Файлы

Копеина Г.С. Люкманова Е.Н. Шингарова Л.Н. Парамонов А.С. Шенкарев З.О. Арсеньев А.С. Долгих Д.А. Кирпичников М.П. Статья в формате PDF 118 KB Мембранные белки составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Данные белки участвуют во взаимодействии клетки с внешней средой, поддержании осмотического баланса, регулировании жизненных процессов, функционировании нервной и эндокринной систем. Особую роль играют потенциалозависимые ионные каналы, которые опосредуют передачу нервного импульса, дефекты в их аминокислотной последовательности и прострaнcтвенной организации во многих случаях обуславливают возникновение и развитие ряда нервных заболеваний. Изучение структуры этих белков затруднено в связи с тем, что мембранные белки имеют гидрофобные трaнcмембранные участки, что значительно осложняет получение этих белков в растворимой форме. При рекомбинантной продукции в бактериальных или эукариотических клетках, эти белки зачастую выпадают в осадок и накапливаются в виде телец включения. Альтернативным подходом является использование бесклеточной системы продукции. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции: во-первых, в такой системе синтезируется преимущественно целевой продукт; во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также детергентов; в-третьих, можно проводить синтез изотопно-меченых по определенным аминокислотным остаткам белков для структурных исследований. Стоит особо отметить, что, например, бактериальная продукция селективно-меченых белков часто затруднена из-за перераспределения метки в процессе клеточного метаболизма. В бесклеточной системе синтез таких белков не осложняется подобными обстоятельствами.Нашей задачей являлась разработка бесклеточной системы продукции селективно-меченого вольт-сенсорного домена К⁺-канала KvAP из термофильной бактерии Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) в растворимой форме в количествах, достаточных для структурных исследований. Для экспрессии гена ВСД-KvAP использовали коммерческий вектор pET28а(+). Электрофоретический анализ показал, что в процессе синтеза пpaктически весь белок агрегирует и детектируется в осадке. Был протестирован целый ряд различных вариантов ренатурации ВСД-KvAP из осадка. При подборе в качестве хаотропных агентов использовали мочевину в концентрации до 8 М и гуанидингидрохлорид (ГГХ) в концентрации до 6 М. Так как ВСД-KvAP имеет трaнcмембранную гидрофобную часть для растворения осадка необходимо было применять детергенты, в экспериментах были использованы следующие детергенты, - додецилсульфат натрия (ДСН), луарилсаркозил и додецилфосфатидилхолин (ДФХ). Процедуру ренатурации проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок белка, полученного в результате бесклеточного синтеза, ресуспендировали в растворе детергента с добавлением/или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили на смоле Ni-Sepharose: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой, далее для избавления от хаотропного агента колонку промывали раствором детергента, в котором изначально растворяли осадок. После этого, детергент заменяли на 1% ДФХ, и затем белок элюировали ступенчато: 100 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазола с добавлением 0.2 % ДФХ. Агрегатное состояние ВСД-KvAP оценивали с помощью электрофореза. Также для ренатурации ВСД-KvAP был применен недетергентный сульфобетаин 201 (НДСБ 201), часто используемый для повышения выхода ренатурации. Однако ни использование НДСБ201, ни замена мочевины на гуанидингидрохлорид, ни использование ДФХ в качестве детергента для исходного растворения осадка не привели к исчезновению агрегатов или увеличению выхода белка. В результате, в качестве оптимальных были признаны следующие условия ренатурации: растворение осадка белка в смеси 4 М мочевины и 2% додецилсульфата натрия и дальнейшая замена ДСН на 0.2% ДФХ с помощью металл-хелатной хроматографии. Отсутствие агрегатов и мономерная форма ВСД-KvAP в растворе 0.2% ДФХ была подтверждена данными гель-электрофореза. Выход конечного продукта при таком подходе составил ~ 0.7 мг/мл трaнcляционной смеси. Для того, чтобы оценить эффективность селективного мечения в бесклеточной системе, синтезировали [¹⁵N]-меченный по аланину ВСД-KvAP. Белок из осадка растворяли в трифторэтаноле и анализировали методом ЯМР. Анализ методами спектроскопии ЯМР показал, что все остатки аланина в белке являются [¹⁵N]-мечеными. Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции селективно-меченого ВСД-KvAP, и были подобраны условия получения этого белка в мономерной форме.

ПОДВИЖНЫЕ ИГРЫ КАК СРЕДСТВО И МЕТОД РАЗВИТИЯ ДВИГАТЕЛЬНЫХ СПОСОБНОСТЕЙ МАЛЬЧИКОВ 7-10 ЛЕТ К ЗАНЯТИЯМ ВОЛЕЙБОЛОМ

Статья в формате PDF 249 KB...

11 10 2026 23:49:26

НОВЫЕ ПРОДУКТЫ ДЛЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПИТАНИЯ

Статья в формате PDF 207 KB...

10 10 2026 20:54:33

32-РАЗРЯДНЫЕ МИКРОКОНТРОЛЛЕРЫ СЕМЕЙСТВА AVR32

Статья в формате PDF 263 KB...

09 10 2026 3:34:48

МОНИТОРИНГ КАК СРЕДСТВО ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ СПЕЦИАЛИСТОВ

Статья в формате PDF 120 KB...

08 10 2026 23:36:19

ОЦЕНКА ПОСЛЕДСТВИЙ АВАРИЙНОГО ВЗРЫВА НА АЗС И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗОН ПОРАЖЕНИЯ

Статья в формате PDF 267 KB...

07 10 2026 7:11:13

КАЧЕСТВО ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ

Статья в формате PDF 130 KB...

06 10 2026 17:16:30

ЭЛЕКТИВНЫЙ КУРС «ЧЕТЫРЕХМЕРНАЯ ГЕОМЕТРИЯ»

Статья в формате PDF 256 KB...

05 10 2026 15:50:11

СТРУКТУРА ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНЫХ СПОСОБНОСТЕЙ ЧЕЛОВЕКА

Статья в формате PDF 149 KB...

04 10 2026 12:27:31

ЧИСЛЕННОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ДЕФОРМИРОВАНИЯ КЕРАМИЧЕСКИХ КОМПОЗИТОВ НА СТАДИИ ПРЕДРАЗРУШЕНИЯ

Статья в формате PDF 1227 KB...

03 10 2026 7:23:21

К ВОПРОСУ ОБ ИСТОРИКО-КУЛЬТУРНОЙ ИДЕНТИЧНОСТИ РОССИИ

Статья в формате PDF 82 KB...

02 10 2026 16:34:18

АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ РИСК – МЕНЕДЖМЕНТА В КОММЕРЧЕСКОМ БАНКЕ

Статья в формате PDF 162 KB...

01 10 2026 21:17:36

ОТДАЛЕННАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ГИСТЕРОРЕЗЕКЦИИ ПОЛИПОВ ЭНДОМЕТРИЯ, КОМБИНИРОВАННОЙ С ГОРМОНАЛЬНОЙ И МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ ТЕРАПИЕЙ, У ЖЕНЩИН В ПОСТМЕНОПАУЗЕ

Статья в формате PDF 260 KB...

30 09 2026 23:55:11

ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ РЕЙТИНГОВОЙ СИСТЕМЫ ОЦЕНОК ПРИ ИЗУЧЕНИИ КУРСА ФИЗИКИ СТУДЕНТАМИ ЧИТИНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА

Статья в формате PDF 122 KB...

29 09 2026 12:32:54

РОЛЬ SE В ТЕЧЕНИИ ЭНДОТОКСИКОЗА ПРИ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ В ГИНЕКОЛОГИИ

Важнейшим фактором поддержания селенового статуса организма является феномен эндогенного регулирования, который проявляется как в здоровом организме, так и при различных заболеваниях. Клинические исследования гинекологических больных с гнойно-воспалительными заболеваниями позволили установить, что снижение иммунной защиты организма часто сопровождается снижением уровня селена в сыворотке крови. Обследовано 46 больных (18-37 лет). Бактериологическое типирование подтвердило присутствие: Chlamidia trachomonatis; Ureaplasma urealiticum; St. epidermidis; грам (-) флоры; грам (+) флоры; смешанной флоры; E. Colli; дрожжевых клеток; трихомонад. Интервал концентрации селена в сыворотке крови составил 32,0-89,5мкг/л. Средний показатель 64,8 ± 6,3 мкг/л (при норме 115-120 мкг/л). Показатель уровня селена в сыворотке крови доноров г.Пензы составил 81,0 ± 11,7 мкг/л. Была проведена оценка влияния селенодефицита на течение и прогноз эндотоксикоза. Таким образом, авторегулирование антиоксидантного гомеостаза в организме можно рассматривать как функцию иммунитета, а воздействие фармакологических препаратов как один из методов регулирования селенового статуса населения. ...

28 09 2026 7:54:38

ПРОГНОЗ ВВП РОССИИ ЗА 2007 ГОД С УЧЕТОМ ДАННЫХ LENTA.RU

Статья в формате PDF 91 KB...

27 09 2026 12:27:40

ГИГИЕНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПДК ДИСПЕРСНЫХ АЗОКРАСИТЕЛЕЙ НА ПРИМЕРЕ ЖЕЛТО-КОРИЧНЕВОГО 2Ж И АЛОГО 2А

Статья в формате PDF 303 KB...

26 09 2026 9:35:57

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ГРАДОСТРОЕНИИ

Статья в формате PDF 254 KB...

25 09 2026 8:54:55

АНАЛИЗ МАРШРУТОВ ДОСТАВКИ АВТОКЛАВА ИЗ КИТАЯ В ГОРОД АМУРСК

Статья в формате PDF 293 KB...

24 09 2026 11:25:44

СОЛОГУБ ТАМАРА ВАСИЛЬЕВНА

Статья в формате PDF 258 KB...

23 09 2026 22:29:18

Туристско-рекреационная оценка климатических условий Ивановской области

Статья в формате PDF 255 KB...

22 09 2026 21:32:51

РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ В Г. ПЕРМИ И В ПЕРМСКОМ КРАЕ

Статья в формате PDF 294 KB...

21 09 2026 7:54:20

ВЛИЯНИЕ ПОВЕРХНОСТНОЙ ОБРАБОТКИ НА УСТАЛОСТНУЮ ПРОЧНОСТЬ И МЕХАНИЗМ РАЗРУШЕНИЯ ЛИТЕЙНЫХ АЛЮМИНИЕВЫХ СПЛАВОВ

Статья в формате PDF 143 KB...

20 09 2026 19:25:32

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ ВЕЛИЧИНЫ ВЗВОДА ДЛЯ МНОГОУДАРНОГО КУЛАЧКОВОГО МЕХАНИЗМА ПРИ НЕКОТОРЫХ УСЛОВИЯХ

Статья в формате PDF 466 KB...

19 09 2026 13:52:16

ПОВЫШЕНИЕ МОЩНОСТНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ГИБРИДНОЙ ЭНЕРГОСИЛОВОЙ УСТАНОВКИ ПАРАЛЛЕЛЬНОЙ КОМПОНОВОЧНОЙ СХЕМЫ ЗА СЧЕТ ПРИМЕНЕНИЯ В КОНСТРУКЦИИ СОГЛАСУЮЩЕГО РЕДУКТОРА ЦЕНТРОБЕЖНОЙ МУФТЫ ДВОЙНОГО ДЕЙСТВИЯ

Статья в формате PDF 120 KB...

18 09 2026 20:47:56

ОСВОЕНИЕ УГЛЕВОДОРОДНЫХ РЕСУРСОВ – ГЛАВНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ ЭКОНОМИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ КНР В XXI ВЕКЕ

Статья в формате PDF 121 KB...

17 09 2026 10:36:15

Роль различных двигательных режимов в адаптационном процессе и педагогической деятельности студентов

Статья в формате PDF 111 KB...

16 09 2026 13:50:54

ДИДАКТИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ ПРОДУКТИВНОЙ УМСТВЕННОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ШКОЛЬНИКОВ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ЗНАНИЙ

Рассматривается проблема организации продуктивной умственной деятельности учащихся общеобразовательных учреждений в системе дидактических принципов современной педагогики. Анализ принципов показывает, что отечественная дидактика в большой мере сохраняет черты традиционной модели обучения и недостаточно учитывает психологическую природу мышления и закономерности продуктивной умственной деятельности при разработке принципов обучения. Выделены основополагающие принципы организации продуктивной умственной деятельности на основе закономерностей развития знания и процесса познания, психологических закономерностей мышления. ...