ЭКСПРЕССИЯ ε-ГЕНА ЭМБРИОНАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНА ПРИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ
Гемоглобины человека изучаются уже на протяжении почти века, но, тем не менее, эмбриональный гемоглобин (HbP, синоним - HbE) является одним из самых малоизученных белков человеческого организма. Сведения о HbP в научной литературе до сих пор крайне скудны. Такой парадоксально низкий интерес ученых к этому белку можно объяснить следующими причинами: а) методологический фактор: получение препарата HbP крайне затруднительно из-за сложностей получения биоматериала (HbP синтезируется только в раннем эмбриогенезе, с 5 по 18 гестации), экстрагирования и очистки белка; б) пpaктический фактор: по мнению большинства клиницистов, данный белок не представляет прикладной (диагностическо-прогностической) ценности, т.к. активность его гена полностью репрессирована как у детей, так и у взрослых [1, 2, 3, 6].
В данной работе авторы исходили из предположения, что активация ε-гена HbP в постнатальном периоде жизни человека возможна при патологии, связанной с понижением степени дифференцировки, т.н. «омоложением» клеток эритроцитарного ростка [4]. К таким состояниям можно отнести некоторые oнкoлoгические заболевания тканей красного костного мозга, в первую очередь, эритремии, сублейкемические миелозы, а также, возможно, некоторые миелолейкозы.
Цель исследования - иммунохимический качественный анализ наличия эмбрионального гемоглобина в эритроцитах больных эритромами, сублейкемическими миелозами и лейкозами различных типов.
В процессе научно-экспериментального исследования физико-химических свойств эмбрионального гемоглобина авторами разработан оптимальный алгоритм выделения этого белка [4].
Исходным биоматериалом для выделения и очистки HbP служил aбopтивный материал сроком 7-9 недель (отделение неонатологии больницы №5 г. Астpaxaни). После промывки и сортировки эмбриональные ткани подвергались механически-термической гомогенизации. После экстрагирования цитозольных белков проводили, взвесь центрифугировали при 8000 g в течение 30 мин, после чего осадок отбрасывали. Поскольку устойчивость эмбрионального гемоглобина несколько ниже, чем у фетального [6], для очистки HbP нами была модифицирована стандартная методика щелочной денатурации для выделения фетального гемоглобина [3, 6], состоящая в 40-секундной обработке смеси 1,2 М раствором NaOH, с последовательным осаждением белков раствором сульфата аммония (до 50%-й насыщенности). После центрифугирования при 8000 об/мин в течение 30 мин осадок отделяли. В надосадочной жидкости оставался эмбриональный гемоглобин с незначительным количеством белковых примесей. Полученный белковый препарат подвергали обессоливанию путем гель-проникающей хроматографии на колонке с сефадексом G-25, рабочий буфер - 0,05 М фосфатный буферный раствор рН 7,4. Окончательную очистку HbP от оставшихся щелочеустойчивых компонентов в полученном на предыдущем этапе препарате проводили путем ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе G-50 на 0,01 М трис-хлоридном буфере рН 8,1 в градиенте ионной силы.
Анализ чистоты полученных препаратов осуществляли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле.
Полученные очищенные препараты HbP использовали, в частности, для получения специфических антисывороток на данный белок методом иммунизации кроликов. Иммунизация проводилась с полным адьювантом Фрейнда по стандартной методике [5]. Для контроля качества антисывороток проводили их иммунохимическое сопоставление с другими антигенными композитами, а также специфическую окраску полученных преципитатов бензидиновым методом [6]. При наличии дополнительных линий преципитации проводили дробное истощение антисыворотки соответствующей белковой фpaкцией. В результате проведенной работы разработаны специфические иммунохимические тест-системы на эмбриональный гемоглобин, в которой тест-антигеном является очищенный препарат HbР (полученный вышеописанным способом) в рабочем разведении: 1/2 или экстpaкт тканей эмбриона (срок - 6-9 недель) в рабочем разведении 1/8-1/16. Тест-системы на использовали для иммунохимической индикации HbP в исследуемом материале.
Объектом нашего исследования являлась гепаринизированная кровь больных некоторыми гематологическими онкозаболеваниями. Всего было обследовано 107 образцов крови. Из них: 12 больных эритромами, 11 больных сублейкемическими миелозами, 31 больных острыми и хроническими миелолейкозами, 17 больных острыми и хроническими лимфолейкозами, а также 36 образцов крови здоровых людей (группа контроля) (табл.1).
Сбор биоматериала проводили в гематологическом отделении 1-й областной больницы г. Астpaxaнь.
Подготовка проб к анализу состояла в их предварительном гемолизе путем двухкратного замораживания (при -180С) и оттаивания.
Таблица 1 Перечень использованного в работе материала
Исследуемый материал (кровь) |
Количество проб |
Здоровые |
36 |
Больные эритремиями |
12 |
Больные сублейкемическими миелозами |
11 |
Больные хроническими миелолейкозами |
22 |
Больные острыми миелолейкозами |
9 |
Больные острыми и хроническими лимфолейкозами |
17 |
ВСЕГО |
107 |
Индикация HbP в образцах осуществлялась путем иммунодиффузии по Оучтерлони [5]. В ходе работы использовались моновалентные иммунохимические тест-системы на HbP (см. выше).
После иммунопроявления агаровые стекла высушивали и подвергали специфическому окрашиванию на гемоглобины гваяколовым методом, модифицированным авторами: 0,2 г гваякола в 50 мл ледяной уксусной кислоты, затем добавляли этот раствор в 0,1М ацетатный буфер рН 4,6 с 0,2% хлоридом марганца (II) до 0,3% концентрации. Туда же добавляли перекись водорода до концентрации 1%. Экспозиция 45 мин. В результате окраски гемоглобиновые преципитаты приобретали гoлyбой цвет.
Стекла фотографировали в отраженно-рассеянном свете. Считывание результатов проводили только по отчетливым окрашенным линиям преципитации.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием статистических компьютерных программ.
В результате проведенного иммунохимического анализа исследуемого материала на эмбриональный гемоглобин методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони получены следующие результаты (табл. 2).
Как видно из приведенных данных, эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови больных эритремиями, хроническими эритромиелозами, сублейкемическими миелозами и острыми миелолейкозами. Эти данные свидетельствуют о возможности дерепрессии гена ε-протомера (гена эмбрионального гемоглобина) при снижении дифференцировки клеток эритроцитарного ростка, сопровождающей oнкoлoгические заболевания данной ткани. Нулевая выявляемость HbP в крови гематологических больных с онкопатологией неэритроидного генеза (острые и хронические лимфолейкозы) согласуется с приведенной версией.
Таблица 2 Результаты иммунохимической индикации HbP в крови онко-гематологических больных
Исследуемый материал |
Количество проб |
Количество положительных результатов на HbP |
Процент положительных результатов на HbP |
Здоровые |
36 |
0 |
0,0 |
Больные эритремиями |
12 |
8 |
66,67 |
Больные сублейкеми-ческими миелозами |
11 |
4 |
36,36 |
Больные хроническими миелолейкозами |
22 |
1 |
4,55 |
Больные острыми миелолейкозами |
9 |
2 |
22,22 |
Больные острыми и хроническими лимфолейкозами |
17 |
0 |
0,0 |
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что иммунохимическая индикация эмбрионального гемоглобина в крови гематологических больных способствует повышению качества дифференциальной диагностики ряда онко-гематологических заболеваний.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
- Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. - СПб, ООО "ЭЛБИ-СПб", 2000. - 384 с.
- Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы патохимии - СПб. «Элби-СПб». - 2000. - 182 с.
- Карпищенко А.И. - Медицинские лабораторные технологии и диагностика / А.И. Карпищенко. - Справочник, т 1, С. Петербург, 1998. - 144 с.
- Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Семенова Т.Б. - Иммунохимический анализ продукции эмбрионального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека / Материалы научно-пpaктической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астpaxaнь-Волгоград-Москва. - 2006. - С.58-62.
- Никулина Д.М. - Пpaктическое освоение иммунохимических методов / Метод. рекомендации. - Астpaxaнь, - 1996. - 36 с.
- Стародуб Н.Ф., Назаренко В.И. - Гетерогенная система гемоглобина: структура, свойства, синтез, биологическая роль / АН УССР, Институт молекулярной биологии и генетики. Киев: Наукова думка, 1987. - 198 с.
Статья в формате PDF
238 KB...
27 09 2023 21:44:39
На основании диагностических признаков приводятся доказательства, указывающие на то, что Chytridiomycosis существует в популяциях Rana arvalis на Среднем Урале. Показана методика обнаружения заболевания по аномалиям ротового аппарата личинок и отслеживания динамики частоты встречаемости его в популяции. В экстремальных условиях инфекция поражает ослабленных и ведет к их выбpaковке, что приводит к ускорению адаптации популяции в целом в быстро изменяемой среде.
...
26 09 2023 13:11:43
Статья в формате PDF
304 KB...
25 09 2023 6:20:35
Статья в формате PDF
100 KB...
24 09 2023 19:41:43
Статья в формате PDF
380 KB...
23 09 2023 3:51:43
Статья в формате PDF
125 KB...
22 09 2023 8:45:56
Статья в формате PDF
303 KB...
21 09 2023 7:17:23
Статья в формате PDF
255 KB...
20 09 2023 7:30:48
Статья в формате PDF
108 KB...
19 09 2023 22:43:28
Статья в формате PDF
134 KB...
17 09 2023 12:27:49
Статья в формате PDF
132 KB...
16 09 2023 4:34:20
Статья в формате PDF
116 KB...
15 09 2023 23:56:38
Статья в формате PDF
296 KB...
14 09 2023 18:21:15
Статья в формате PDF
100 KB...
13 09 2023 0:20:22
Статья в формате PDF
264 KB...
12 09 2023 8:19:32
Статья в формате PDF
265 KB...
11 09 2023 0:15:37
Статья в формате PDF
114 KB...
10 09 2023 15:50:17
В данной статье выделены основные подходы к проблеме человека, сложившиеся в истории казахской традиции и современной казахской философской мысли. По мнению автора, в объяснении феномена человека казахской традицией можно найти ряд толкований, пояснений, отражающих особое внимание к человеку, его духовному миру, самоценности, достоинству, чести. Именно на этой основе казахская национальная традиция получает возможность сосредоточиться на рассмотрении своего видения проблемы отношения человека и мира.
...
09 09 2023 4:48:10
Статья в формате PDF
116 KB...
08 09 2023 12:28:37
Статья в формате PDF
215 KB...
07 09 2023 22:14:34
Статья в формате PDF
123 KB...
06 09 2023 10:44:56
Статья в формате PDF
262 KB...
05 09 2023 0:46:12
Статья в формате PDF
131 KB...
04 09 2023 16:54:10
Статья в формате PDF
115 KB...
03 09 2023 7:34:39
Статья в формате PDF
311 KB...
02 09 2023 19:49:42
Статья в формате PDF
139 KB...
01 09 2023 0:37:12
Статья в формате PDF
313 KB...
31 08 2023 17:38:13
Статья в формате PDF
263 KB...
28 08 2023 12:29:46
Статья в формате PDF
261 KB...
26 08 2023 2:39:12
Работа посвящена физическому моделированию торцевого выпуска руды при системах с обрушением руды и вмещающих пород. Актуальность темы определяется необходимостью повышения эффективности отработки рудных месторождений полезных ископаемых с применением систем с обрушением. Рассматриваемые системы хаpaктеризуются высокими показателями потерь и разубоживания руды. Моделирование выпуска руды позволят решать вопрос оптимизации параметров системы разработки и совершенствования технологических процессов очистной выемки.
...
25 08 2023 15:19:26
Статья в формате PDF
253 KB...
24 08 2023 19:21:56
Статья в формате PDF
120 KB...
23 08 2023 23:47:19
Статья в формате PDF
262 KB...
22 08 2023 18:26:46
В работе приводится анализ мотивации выбора профессии педагога на основе изучения профессиональной ориентации в группе студентов факультета дополнительных профессий СГПИ.
...
21 08 2023 19:21:58
Статья в формате PDF
109 KB...
20 08 2023 0:33:43
19 08 2023 6:20:19
Еще:
Поддержать себя -1 :: Поддержать себя -2 :: Поддержать себя -3 :: Поддержать себя -4 :: Поддержать себя -5 :: Поддержать себя -6 :: Поддержать себя -7 :: Поддержать себя -8 :: Поддержать себя -9 :: Поддержать себя -10 :: Поддержать себя -11 :: Поддержать себя -12 :: Поддержать себя -13 :: Поддержать себя -14 :: Поддержать себя -15 :: Поддержать себя -16 :: Поддержать себя -17 :: Поддержать себя -18 :: Поддержать себя -19 :: Поддержать себя -20 :: Поддержать себя -21 :: Поддержать себя -22 :: Поддержать себя -23 :: Поддержать себя -24 :: Поддержать себя -25 :: Поддержать себя -26 :: Поддержать себя -27 :: Поддержать себя -28 :: Поддержать себя -29 :: Поддержать себя -30 :: Поддержать себя -31 :: Поддержать себя -32 :: Поддержать себя -33 :: Поддержать себя -34 :: Поддержать себя -35 :: Поддержать себя -36 :: Поддержать себя -37 :: Поддержать себя -38 ::