ЭКСПРЕССИЯ ε-ГЕНА ЭМБРИОНАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНА ПРИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ
Гемоглобины человека изучаются уже на протяжении почти века, но, тем не менее, эмбриональный гемоглобин (HbP, синоним - HbE) является одним из самых малоизученных белков человеческого организма. Сведения о HbP в научной литературе до сих пор крайне скудны. Такой парадоксально низкий интерес ученых к этому белку можно объяснить следующими причинами: а) методологический фактор: получение препарата HbP крайне затруднительно из-за сложностей получения биоматериала (HbP синтезируется только в раннем эмбриогенезе, с 5 по 18 гестации), экстрагирования и очистки белка; б) пpaктический фактор: по мнению большинства клиницистов, данный белок не представляет прикладной (диагностическо-прогностической) ценности, т.к. активность его гена полностью репрессирована как у детей, так и у взрослых [1, 2, 3, 6].
В данной работе авторы исходили из предположения, что активация ε-гена HbP в постнатальном периоде жизни человека возможна при патологии, связанной с понижением степени дифференцировки, т.н. «омоложением» клеток эритроцитарного ростка [4]. К таким состояниям можно отнести некоторые oнкoлoгические заболевания тканей красного костного мозга, в первую очередь, эритремии, сублейкемические миелозы, а также, возможно, некоторые миелолейкозы.
Цель исследования - иммунохимический качественный анализ наличия эмбрионального гемоглобина в эритроцитах больных эритромами, сублейкемическими миелозами и лейкозами различных типов.
В процессе научно-экспериментального исследования физико-химических свойств эмбрионального гемоглобина авторами разработан оптимальный алгоритм выделения этого белка [4].
Исходным биоматериалом для выделения и очистки HbP служил aбopтивный материал сроком 7-9 недель (отделение неонатологии больницы №5 г. Астpaxaни). После промывки и сортировки эмбриональные ткани подвергались механически-термической гомогенизации. После экстрагирования цитозольных белков проводили, взвесь центрифугировали при 8000 g в течение 30 мин, после чего осадок отбрасывали. Поскольку устойчивость эмбрионального гемоглобина несколько ниже, чем у фетального [6], для очистки HbP нами была модифицирована стандартная методика щелочной денатурации для выделения фетального гемоглобина [3, 6], состоящая в 40-секундной обработке смеси 1,2 М раствором NaOH, с последовательным осаждением белков раствором сульфата аммония (до 50%-й насыщенности). После центрифугирования при 8000 об/мин в течение 30 мин осадок отделяли. В надосадочной жидкости оставался эмбриональный гемоглобин с незначительным количеством белковых примесей. Полученный белковый препарат подвергали обессоливанию путем гель-проникающей хроматографии на колонке с сефадексом G-25, рабочий буфер - 0,05 М фосфатный буферный раствор рН 7,4. Окончательную очистку HbP от оставшихся щелочеустойчивых компонентов в полученном на предыдущем этапе препарате проводили путем ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе G-50 на 0,01 М трис-хлоридном буфере рН 8,1 в градиенте ионной силы.
Анализ чистоты полученных препаратов осуществляли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле.
Полученные очищенные препараты HbP использовали, в частности, для получения специфических антисывороток на данный белок методом иммунизации кроликов. Иммунизация проводилась с полным адьювантом Фрейнда по стандартной методике [5]. Для контроля качества антисывороток проводили их иммунохимическое сопоставление с другими антигенными композитами, а также специфическую окраску полученных преципитатов бензидиновым методом [6]. При наличии дополнительных линий преципитации проводили дробное истощение антисыворотки соответствующей белковой фpaкцией. В результате проведенной работы разработаны специфические иммунохимические тест-системы на эмбриональный гемоглобин, в которой тест-антигеном является очищенный препарат HbР (полученный вышеописанным способом) в рабочем разведении: 1/2 или экстpaкт тканей эмбриона (срок - 6-9 недель) в рабочем разведении 1/8-1/16. Тест-системы на использовали для иммунохимической индикации HbP в исследуемом материале.
Объектом нашего исследования являлась гепаринизированная кровь больных некоторыми гематологическими онкозаболеваниями. Всего было обследовано 107 образцов крови. Из них: 12 больных эритромами, 11 больных сублейкемическими миелозами, 31 больных острыми и хроническими миелолейкозами, 17 больных острыми и хроническими лимфолейкозами, а также 36 образцов крови здоровых людей (группа контроля) (табл.1).
Сбор биоматериала проводили в гематологическом отделении 1-й областной больницы г. Астpaxaнь.
Подготовка проб к анализу состояла в их предварительном гемолизе путем двухкратного замораживания (при -180С) и оттаивания.
Таблица 1 Перечень использованного в работе материала
Исследуемый материал (кровь) |
Количество проб |
Здоровые |
36 |
Больные эритремиями |
12 |
Больные сублейкемическими миелозами |
11 |
Больные хроническими миелолейкозами |
22 |
Больные острыми миелолейкозами |
9 |
Больные острыми и хроническими лимфолейкозами |
17 |
ВСЕГО |
107 |
Индикация HbP в образцах осуществлялась путем иммунодиффузии по Оучтерлони [5]. В ходе работы использовались моновалентные иммунохимические тест-системы на HbP (см. выше).
После иммунопроявления агаровые стекла высушивали и подвергали специфическому окрашиванию на гемоглобины гваяколовым методом, модифицированным авторами: 0,2 г гваякола в 50 мл ледяной уксусной кислоты, затем добавляли этот раствор в 0,1М ацетатный буфер рН 4,6 с 0,2% хлоридом марганца (II) до 0,3% концентрации. Туда же добавляли перекись водорода до концентрации 1%. Экспозиция 45 мин. В результате окраски гемоглобиновые преципитаты приобретали гoлyбой цвет.
Стекла фотографировали в отраженно-рассеянном свете. Считывание результатов проводили только по отчетливым окрашенным линиям преципитации.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием статистических компьютерных программ.
В результате проведенного иммунохимического анализа исследуемого материала на эмбриональный гемоглобин методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони получены следующие результаты (табл. 2).
Как видно из приведенных данных, эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови больных эритремиями, хроническими эритромиелозами, сублейкемическими миелозами и острыми миелолейкозами. Эти данные свидетельствуют о возможности дерепрессии гена ε-протомера (гена эмбрионального гемоглобина) при снижении дифференцировки клеток эритроцитарного ростка, сопровождающей oнкoлoгические заболевания данной ткани. Нулевая выявляемость HbP в крови гематологических больных с онкопатологией неэритроидного генеза (острые и хронические лимфолейкозы) согласуется с приведенной версией.
Таблица 2 Результаты иммунохимической индикации HbP в крови онко-гематологических больных
Исследуемый материал |
Количество проб |
Количество положительных результатов на HbP |
Процент положительных результатов на HbP |
Здоровые |
36 |
0 |
0,0 |
Больные эритремиями |
12 |
8 |
66,67 |
Больные сублейкеми-ческими миелозами |
11 |
4 |
36,36 |
Больные хроническими миелолейкозами |
22 |
1 |
4,55 |
Больные острыми миелолейкозами |
9 |
2 |
22,22 |
Больные острыми и хроническими лимфолейкозами |
17 |
0 |
0,0 |
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что иммунохимическая индикация эмбрионального гемоглобина в крови гематологических больных способствует повышению качества дифференциальной диагностики ряда онко-гематологических заболеваний.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
- Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. - СПб, ООО "ЭЛБИ-СПб", 2000. - 384 с.
- Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы патохимии - СПб. «Элби-СПб». - 2000. - 182 с.
- Карпищенко А.И. - Медицинские лабораторные технологии и диагностика / А.И. Карпищенко. - Справочник, т 1, С. Петербург, 1998. - 144 с.
- Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Семенова Т.Б. - Иммунохимический анализ продукции эмбрионального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека / Материалы научно-пpaктической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астpaxaнь-Волгоград-Москва. - 2006. - С.58-62.
- Никулина Д.М. - Пpaктическое освоение иммунохимических методов / Метод. рекомендации. - Астpaxaнь, - 1996. - 36 с.
- Стародуб Н.Ф., Назаренко В.И. - Гетерогенная система гемоглобина: структура, свойства, синтез, биологическая роль / АН УССР, Институт молекулярной биологии и генетики. Киев: Наукова думка, 1987. - 198 с.
Статья в формате PDF
100 KB...
09 07 2025 11:38:32
Статья в формате PDF
601 KB...
07 07 2025 4:38:54
Статья в формате PDF
116 KB...
06 07 2025 11:51:54
Статья в формате PDF
139 KB...
05 07 2025 13:42:47
Статья в формате PDF
121 KB...
04 07 2025 1:35:15
Статья в формате PDF
118 KB...
03 07 2025 16:24:51
Статья в формате PDF
112 KB...
01 07 2025 17:19:59
Статья в формате PDF
127 KB...
30 06 2025 0:50:31
Статья в формате PDF
250 KB...
29 06 2025 21:22:39
Статья в формате PDF
390 KB...
28 06 2025 6:55:48
Статья в формате PDF
121 KB...
27 06 2025 22:44:28
Статья в формате PDF
122 KB...
26 06 2025 13:48:19
Статья в формате PDF
161 KB...
25 06 2025 5:15:19
Статья в формате PDF
102 KB...
24 06 2025 16:28:56
Статья в формате PDF
220 KB...
23 06 2025 22:28:32
Статья в формате PDF
116 KB...
22 06 2025 6:56:34
Статья в формате PDF
266 KB...
21 06 2025 17:47:32
Статья в формате PDF
109 KB...
20 06 2025 10:48:31
Статья в формате PDF
218 KB...
19 06 2025 4:17:21
Статья в формате PDF
106 KB...
18 06 2025 21:56:23
В статье рассмотрена категория «инновация», как экономическое явление, что позволило дополнить отраженные в научной литературе критерии классификации инноваций. Определено, что важнейшей формой оказания государственной поддержки инноваций является повышение эффективности государственных расходов.
...
16 06 2025 7:19:44
Статья в формате PDF
134 KB...
15 06 2025 23:19:52
13 06 2025 15:30:12
Статья в формате PDF
100 KB...
12 06 2025 6:18:21
Статья в формате PDF
125 KB...
11 06 2025 16:56:23
Статья в формате PDF
124 KB...
09 06 2025 5:19:51
Статья в формате PDF
108 KB...
08 06 2025 11:57:52
Статья в формате PDF
124 KB...
07 06 2025 20:59:48
Статья в формате PDF
112 KB...
06 06 2025 21:22:22
Статья в формате PDF
127 KB...
04 06 2025 19:56:31
Статья в формате PDF
126 KB...
03 06 2025 17:49:51
Статья в формате PDF
105 KB...
02 06 2025 0:30:12
Еще:
Поддержать себя -1 :: Поддержать себя -2 :: Поддержать себя -3 :: Поддержать себя -4 :: Поддержать себя -5 :: Поддержать себя -6 :: Поддержать себя -7 :: Поддержать себя -8 :: Поддержать себя -9 :: Поддержать себя -10 :: Поддержать себя -11 :: Поддержать себя -12 :: Поддержать себя -13 :: Поддержать себя -14 :: Поддержать себя -15 :: Поддержать себя -16 :: Поддержать себя -17 :: Поддержать себя -18 :: Поддержать себя -19 :: Поддержать себя -20 :: Поддержать себя -21 :: Поддержать себя -22 :: Поддержать себя -23 :: Поддержать себя -24 :: Поддержать себя -25 :: Поддержать себя -26 :: Поддержать себя -27 :: Поддержать себя -28 :: Поддержать себя -29 :: Поддержать себя -30 :: Поддержать себя -31 :: Поддержать себя -32 :: Поддержать себя -33 :: Поддержать себя -34 :: Поддержать себя -35 :: Поддержать себя -36 :: Поддержать себя -37 :: Поддержать себя -38 ::