ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ КАТИОННОГО АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА ИЗ НЕЙТРОФИЛОВ СВИНЬИ ПРОТЕГРИНА 1 И ЕГО СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ

1

• Авторы
• Файлы

Шамова О.В. Сакута Г.А. Орлов Д.С. Миргородская О.А. Кокряков В.Н. Тверьянович И.А. Попова В.А. Статья в формате PDF 122 KB

Нейтрофильные гранулоциты обеспечивают передовую линию защиты организма от инфекционных агентов и являются одними из основных клеточных эффекторов в фагоцитарных и воспалительных реакциях. Роль нейтрофилов в обеспечении противоопухолевой защиты организма в настоящее время изучена не до конца. Интенсивно изучаются возможности взаимодействия нейтрофилов с различными клетками системы врожденного и приобретенного иммунитета, участвующими в обеспечении защиты организма от трaнcформированных клеток (Carlo et al., Annu. Rev. Immunol 1993, 11, p.105-108). Однако, хотя давно известно, что нейтрофилы содержат факторы, обладающие прямым противоопухолевым действием, лишь немногочисленные работы посвящены изучению этих факторов. Одними из важнейших эффекторных молекул нейтрофилов являются катионные пептиды с антимикробной активностью. Эти пептиды проявляют антимикробную активность против широкого спектра бактерий, грибков, некоторых оболочечных вирусов. Для некоторых из них была показана и цитотоксическая активность против клеток макроорганизма (Lichtenstein A., J. Clin. Invest, 1991, 88, p. 93-100; Risso et al., Molecular and Cellular Biology, 2002, 22, p. 1926-35). При этом большинство пептидов, обладающих такой активностью, лизировали как трaнcформированные, так и нормальные клетки.   Лишь несколько из них демонстрировали некоторую селективность по отношению к опухолевым клеткам. Однако механизм действия антимикробных нейтрофильных пептидов на эукариотические клетки пока остается малоизученным. Не понятно и какие особенности структуры пептидов обусловливают их избирательную цитотоксическую активность в отношении трaнcформированных клеток. Таким образом, изучение механизмов взаимодействия антимикробных пептидов из нейтрофильных гранулоцитов с опухолевыми клетками поможет, с одной стороны, прояснить роль нейтрофилов в обеспечении противоопухолевой защиты организма, с другой понять, как действие пептидов  на клетки связано с особенностями их структуры, что откроет возможность моделирования синтетических пептидов с направленной активностью в отношении трaнcформированных клеток и в перспективе создания лекатственных препаратов на основе таких моделей.

В нашей работе была исследована противоопухолевая активность протегрина 1, пептида из нейтрофилов свиньи, известного как один из самых активных из известных антимикробных пептидов животного происхождения (Kokryakov et al., FEBS Lett. 1993, 327, 2, p. 231-236). Протегрин 1 состоит из 18 аминокислот, причем шесть из них представлены аргинином, что и определяет высокий положительный заряд этого пептида. В состав его молекулы входят также четыре цистеина, образующих два дисульфидных мостика.

Нами было изучено цитотоксическое действие протегрина 1 на клетки эритромиелоидной лейкемии человека К562, гистиоцитарной лимфомы человека U-937 и миеломы мыши NS-1. Пептид добавляли к клеточным суспензиям до конечной концентрации 5 мкг/мл и инкубировали сутки. Количество выживших клеток определяли с помощью МТТ анализа (Antibacterial peptides protocols, Ed. W. Shafer, 1997). Необходимо отметить, что до настоящего времени противоопухолевая активность нейтрофильных антимикробных пептидов проявлялась лишь при условии, что пептиды контактируют с клетками, находящимися в среде, в которой отсутствовали компоненты сыворотки крови. В присутствии сыворотки активность пептидов терялась. Поэтому представляло интерес выяснить, как влияет присутствие сыворотки на цитотоксическую активность. В результате проведенных экспериментов нами было показано, что протегрин 1 имеет противоопухолевую активность в отношении всех трех исследованных клеточных линий, причем присутствие сыворотки по-разному сказывается на его активности в случае каждой клеточной линии. Так протегрин 1 убивал около 85% клеток линии U-937 в бессывороточной среде и лишь около 40% в среде, содержащей 10% бычьей фетальной  сыворотки. На цитотоксическое действие протегрина 1 в отношении К-562 присутствие сыворотки не оказывало столь заметного эффекта: пептид вызывал гибель около 30% клеток в присутствии сыворотки и около 50% в ее отсутствии. Для клеток линии NS-1 картина была иная: протегрин 1 был активен только в присутствии сыворотки, убивая около 50% клеток и не влияя на их жизнеспособность в бессывороточной среде.

Таким образом, нами впервые было показано, что протегрин 1 свиньи может проявлять противоопухолевую активность в присутствии сыворотки крови. Этот наблюдение важно как для того, чтобы рассматривать этот пептид как возможную модель для разработки противоопухолевых медицинских препаратов, так и как интересная информация для анализа механизмов действия пептидов на животные клетки. Для дальнейшего исследования этих механизмов была предпринята попытка создания ряда синтетических аналогов протегрина 1 с различными модификациями в структуре и далее анализ их цитотоксического действия. Одной из наиболее важных хаpaктеристик протегрина 1 является наличие в его структуре двух дисульфидных связей, которые обусловливают его третичную структуру - так называемой «бета-шпильки», которая важна для взаимодействия этого пептида с клеточными мембранами и, следовательно, его литической активности как против бактериальных, так и эукариотических клеток. Необходимо отметить, что многие нейтрофильные катионные пептиды, в том числе, протегрин 1, наряду с высокой антимикробной активностью демонстрируют и значительную гемолитическую активность, что делает проблематичным перспективу их использования как леарственных препаратов. Показалось интересным узнать, как изменение расположения и числа дисульфидных связей может влиять на биологическую активность пептида. Был синтезирован ряд протегриноподобных пептидов со структурными отличиями для проведения в дальнейшем структурно-функционального анализа биологических свойств протегриноподобных пептидов; три из них были исследованы в представленной работе:  P45:RRLCYCRRRFCICV с S-S связями в положении С4-С13,C6-C11,  P90:LYCADPRCRPCRRRFCNPCADPRCKH S-S связи C3-C24, C8-C19, C11-C16,   P91:RYCADPRCRPCYNPRCRF  S-S связи   C3-C16, C8-C11.  Все эти три пептида имели антимикробную активность, сходную с активностью протегрина. Однако они отличались по способности вызывать лизис эритроцитов человека: Р-45 был сильным гемолитиком, как и исходный протегрин, тогда как два других пептида пpaктически не вызывали гемолиза эритроцитов. В наших экспериментах было показано, что все три синтетических пептида имели сходную цитотоксическую активность против клеточных линий К-562, U-937, NS-1. Причем в отношении К-562 их активность была сходной и с таковой протегрина 1, в то время как в отношении U-937 наблюдались значительные различия: все три синтетических пептида вызывали гибель клеток только в присутствии в среде сыворотки и полностью теряли активность в ее отсутствии. В случае NS-1 исследуемые три пептида оказывали более выраженное цитотоксическое действие в присутствии сыворотки. Интересно заметить, что, не смотря на то, что пептид Р-45 казывал сильное гемолитическое действие на эритроциты человека, его цитотоксическая активность в отношении трaнcформированных клеток пpaктически не отличалась от активности пептидов Р-90 и Р-90, не являющихся гемолитиками.

Таким образом полученные результаты указывают на важну роль расположения дисульфидных связей в протегриноподобных пептидах для проявления их цитотоксической активности при значительной антимикробной активности всех синтезированных пептидов. Природный пептид, протегрин-1, обладает выраженной цитотоксической активностью в отношении животных клеток, а его способность лизировать эритроциты человека ставит под сомнение возможность его клинического использования. Полученные нами данные свидетельствуют в пользу предположения о возможности создания на основе протегрина молекулы - прототипа антибиотиков нового поколения.

Работа подержана грантами РФФИ № 03-04-747; РФФИ № 03-04-576 и РФФИ № 03-04-49346.

---