АНАЛИЗ АССОЦИАЦИЙ ПО СОЧЕТАНИЯМ ГЕНОТИПОВ ПОЛИМОРФНЫХ ДНК – ЛОКУСОВ (TAG 1A И NCOI) DRD2, 256A/G ГЕНА SLC6A3 И ОБЪЕМНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК МИНДАЛЕВИДНОГО КОМПЛЕКСА МОЗГА С ПОВЫШЕННОЙ ТРЕВОЖНОСТЬЮ

1

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Калимуллина Л.Б. Ахмадеев А.В. Ханнанова А.Я. Впервые показано, что у крыс с генотипом А2/А2 по локусу TAG 1A DRD2 с повышенной тревожностью имеет место сочетание генотипов N2N2 локуса NcoI DRD2 и АА локуса 256A/G гена SLC6A3, а также увеличение объемных хаpaктеристик базолатеральной группировки миндалевидного комплекса мозга. Статья в формате PDF 287 KB полиморфные ДНКлокусы (TAG 1A и NcoI) DRD2локус 256A/G SLC6A3миндалевидный комплекс мозгатревожность Акмаев И.Г., Калимуллина Л.Б. Миндалевидный комплекс мозга: функциональная морфология и нейроэндокринология. - М.: Наука, 1993. - 272 с. Башкатова В.Г. // Психофармакология и биологическая наркология. - 2008. - Т. 8. - С. 17. Дыгало Н.Н. // Успехи физиол. наук. - 2007. - Т. 38, № 1. - С. 3. Казанцева А.В., Гайсина Д.А., Малых С.Б., Хуснутдинова Э.К. // Медицинская генетика. - 2008. - №3. - С. 3. Куликова М.А., Трушкин Е.В., Малюченко Н.В. // Бюлл. экспер. Биол. и мед. - 2008. - Т. 145, №11. - С. 674. Леушкина Н.Ф., Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. // Фундам. Исследования. - 2010. - № 5. - С. 34. Леушкина Н.Ф., Калимуллина Л.Б. // Успехи современного естествознания. - 2010. - № 10. - С. 14. Леушкина Н.Ф., Ханнанова А. Я., Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б. // Успехи современного естествознания. - 2011. - № 5. - С. 16. Brown S.L., Steinberg R.L.,Van Praag H.M. // Handbook of depression and anxiety. - 1994. - Р. 313. Ishikawa A., Nakamura S. // J.Neurosci. - 2003. - Vol. 23, №31. - Р. 9987. Kang-Park M-H, Wilson W., Moore S. // Neuropharmacology. - 2004. - Vol. 46, №1. - Р. 1. Lanuza E., Nader K., Ledoux J. // Neuroscience. - 2004. - Vol. 125. - Р. 305. McDonald A. J. // J. Соmр. Neurol. - 1987. - Vol. 262, №1. - Р. 46.

В настоящее время «дофаминовая» гипотеза происхождения и развития тревожно-депрессивных расстройств является одной из ведущих. В связи с этим работы по изучению молекулярно-генетических механизмов, определяющих тревожно-депрессивное поведение, направлены, в основном, на изучение генов, вовлеченных в метаболизм дофамина [5].

Развитие молекулярной биологии в настоящее время позволяет выявить точечные мутации определенных генов, что находит все более широкое применение в нейробиологии тревожно-депрессивных расстройств. Один из наиболее перспективных методов - это анализ сцепленности определенных генов или полиморфных маркеров. Существует гипотеза о влиянии полиморфизмов в генах DRD2 и SLC6A3 на уровень внеклеточного дофамина либо посредством обратного захвата дофамина из синаптической щели (для переносчика дофамина), либо путем изменения тонического выброса дофамина (для ауторецепторов DRD2, [9]).

Немаловажное значение для выяснения патогенеза тревожно-депрессивных расстройств имеют исследования их структурного базиса, позволяющие выявить конкретные структуры мозга, вовлеченные в их формирование. Прогресс знаний в этом направлении в последние годы связан с использованием в диагностике методов нейровизуализации, в экспериментальных работах реализуется структурно-функциональный подход.

В ранее проведенных исследованиях поведения (открытое поле, приподнятый крестообразный лабиринт) двух групп крыс линии WAG/Rij с генотипами А₁/А₁ и А₂/А₂ по локусу TAG 1A DRD2 (далее группы А1А1 и А2А2) было показано, что крысы А2А2 проявляют повышенный уровень базовой тревожности [6, 7]. Анализ содержания и метаболизма дофамина в миндалевидном комплексе мозга (МК) - ключевой структуре нейронных сетей тревожности выявил, что у крыс А2А2 снижено содержание дофамина и замедлен его метаболизм. Молекулярно-генетический анализ локуса NcoI гена рецептора дофамина (DRD2), а затем и локуса 256A/G гена переносчика дофамина (SLC6A3) у крыс А2А2 выявил ассоциацию каждого из этих локусов (NcoI DRD2 и 256A/G SLC6A3) с повышенной тревожностью.

Целью данного сообщения является изложение результатов анализа ассоциаций по сочетаниям генотипов указанных выше полиморфных локусов генов дофаминергической системы мозга в двух группах крыс линии WAG/Rij, различающихся по уровню тревожности, а также сравнительный анализ у крыс указанных групп морфометрических хаpaктеристик МК.

Все эксперименты проведены с соблюдением норм биомедицинской этики. Исследование полиморфных локусов DRD2 и SLC6A3 проведено на 90 крысах (по 45 крыс в группах), методика выделения ДНК и выявления аллельного полиморфизма описана ранее [8]. Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «Statistic for Windows 5.5», программного обеспечения MS Excel 98 (Microsoft). Для проверки соответствия эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга использовался модифицированный критерий χ² (Р), определяемый с помощью программы Biostat. При попарном сравнении частот генотипов в группах крыс А1А1 и А2А2 (с тревожным поведением) использовался критерий χ² (Р) для таблиц сопряжённости 2×2 с поправкой Йетса на непрерывность. Силу ассоциаций с тревожным поведением оценивали в значениях показателя соотношения шансов (odds ratio, OR) по формуле: OR = (a∙d)/(b∙c). При OR = 1 нет ассоциации, OR > 1 рассматривали как положительную ассоциацию данной формы поведения с генотипом («фактор повышенного риска») и OR < 1 - как отрицательную ассоциацию («фактор пониженного риска»).

Для проведения морфометрического исследования использовано 20 крыс (по 10 особей в группе). Для измерения площади МК на фронтальных срезах мозга использовали цитоархитектонические препараты, окрашенные по Нисслю. Микрофото получали с использованием цифрового фотоаппарата Nicon CoolPix 4500. Полученные изображения экспортировали в компьютер и анализировали с помощью программы JmageJ 1.38 (USA). Вычисляли удельные площади МК и его структур в полушариях мозга. Использовали критерий φ (фи) для обеспечения нормального распределения в получаемых вариационных рядах. Сравнение вариационных рядов проводили с помощью пакета программ «Statistica 5.5».

Результаты проведенного анализа ассоциаций по сочетаниям генотипов генов DRD2 и SLC6A3, как в группе крыс А2А2, имеющих повышенный уровень тревожности, так и в группе крыс А1А1, представлены в табл. 1.

Таблица 1. Частоты сочетаний генотипов полиморфного локуса NcoI гена DRD2 и 256A/G гена SLC6A3 в группах крыс А1А1 и А2А2

Генотипы	Частоты сочетаний генотипов
DRD2	N1/N1			N1/N2			N2/N2
SLC6A3	A/A	A/G	G/G	A/A	A/G	G/G	A/A	A/G	G/G
A1A1	0,10	0,31	0	0,26	0,03	0,15	0,05	0,05	0
A2A2	0,12	0,12	0,03	0,32	0,09	0	0,22*	0,09	0

Примечание. * - OR = 5,56 - маркер риска по сочетаниям генотипов полиморфных локусов DRD2 и SLC6A3.

Из 9 возможных сочетаний генотипов, в группе крыс А2А2 и А1А1 выявлено 8. В группе крыс А1А1 наибольшую частоту имеет сочетание генотипа N₁/N₁ DRD2 - A/G SLC6A3 - 0,31, следующим по частоте встречаемости является сочетание N₁/N₂ DRD2 - A/A SLC6A3 - 0,26. Сочетание генотипа N₁/N₂ DRD2 - A/G SLC6A3 встречается с частотой - 0,03. В группе крыс А2А2 наибольшую частоту имеет генотип N₂/N₂ DRD2 - A/A SLC6A3 - 0,22. В обеих группах отсутствует сочетание генотипов N₂/N₂ - G/G.

Согласно полученным данным, сочетание генотипов N₂/N₂ DRD2 - A/A SLC6A3 является маркером риска тревожного поведения (c²= 3,91, df = 1, p = 0,048, OR = 5,56, 95 % 1,17-117,07). Обращает на себя внимание, что коэффициент отношения шансов (OR) при сочетании генотипов N₂/N₂ DRD2 - A/A SLC6A3 выше, чем для отдельно взятого генотипа риска N₂/N₂ DRD2 (OR = 4,29, 95 %CI 1,17 - 17,76), так и для генотипа A/A SLC6A3 (OR = 2,77, 95 %CI 1,02 - 7,64). Таким образом, два гена при сочетании, как бы усиливают свое влияние на риск развития тревожного поведения.

Известно, что центральное место в функциональной системе, определяющей формирование тревожности и стpaxa, занимает МК, при этом ведущее значение среди структур МК приписывают его базолатеральной группировке [11, 12]. Этот факт указывал на необходимость проведения сравнительного морфометрического исследования МК у двух групп крыс, использованных в работе.

Проведенные исследования показали, что между двумя группами крыс (А1А1 и А2А2) не существует различий по общей удельной площади МК. Удельная площадь у крыс А1А1 равна 20,17 ± 0,53, у крыс А2А2 она составляет 19,39 ± 0,36 (t = 1,58, p = 0,11). Однако мы обнаружили значимые различия в величине удельной площади комплекса базолатеральных ядер, удельная площадь, как в правом и левом полушариях больше у крыс А2А2. Результаты сравнения величины удельных площадей по этой структуре МК приведены в табл. 2.

Таблица 2. Результаты сравнения удельных площадей базолатерального комплекса МК у крыс А1А1 и А2А2

Полушарие, генотип	Левое А1/А1	T, p	Левое А2/А2	Правое А1/А1	T, p	Правое А2/А2
Уд. площадь φ)	0,839 ± 0,021	t = 3,44, p = 0,004	0,934 ± 0,011	0,851 ± 0,025	t = 2,98, p = 0,014	0,943 ± 0,009

Данные табл. 2 показывают, что удельная площадь базолатеральной группировки у крыс А2А2 значимо больше как в правом (p = 0,014), так и в левом (p = 0,004) полушариях по сравнению с крысами А1А1.

Анализ связей латерального ядра МК [1] свидетельствует, что информация от латерального ядра широко иррадиирует в интегративные центры мозга, включающие в себя как высшие висцеральные ядра (гипоталамус), так и подкорковые и корковые формации всех рангов. Эфференты базолатерального ядра следуют к различным отделам промежуточного мозга и подкорковых ядер, а также к формациям новой коры (фронтальной, агранулярной инсулярной, височной) 10]. Каудальные две трети ядра проецируются к передней поясной коре: передняя одна треть - к моторной и префронтальной коре [13]. Эти сведения отражают широкие связи ядер базолатерального комплекса с формациями новой и старой коры, что позволяет предполагать, что увеличение удельной площади базолатерального комплекса ядер МК может отражать особенности нейронных сетей, участвующих в формировании тревожности и передаче этой информации в высшие отделы мозга.

Итак, результаты работы впервые выявили:

1. повышенная базовая тревожность, которая регистрируется у крыс линии WAG/Rij с генотипом А₂/А₂ по локусу TAG 1A DRD2 при исследовании поведения в условиях новизны обстановки (в тесте «открытое поле») и в приподнятом крестообразном лабиринте (наиболее признанном тесте при оценке уровня тревожности у грызунов, [3]) ассоциирована с сочетанием генотипов N₂/N₂ DRD2 - A/A SLC6A3;
2. повышенная базовая тревожность ассоциирована с увеличением площади базолатеральной группировки МК.

На роль локуса TAG 1A DRD2 в формировании тревожности у человека есть указание в работе Куликовой [5], которая исследовала ряд генетических полиморфизмов дофаминергической системы - DAT 40 bp VNTR, DRD2 Taq1A и COMT Val158Met. Также известно, что полиморфный локус NcoI находится в неравновесии по сцеплению с локусом Taq1A гена DRD2, в частности, аллель А₂ DRD2 локуса Taq1A сцеплен с аллелем N₂ DRD2 локуса NcoI, а также о наличии ассоциации гаплотипа А₂/N₂ DRD2 с повышенным нейротизмом (чертой тревожного ряда, [4]). Наши данные согласуются с приведенными сведениями литературы и дополняют их, указывая на роль локуса 256A/G гена SLC6A3.

Использованные к нашей работе крысы с повышенной базовой тревожностью, имеющие гаплотип DRD2 A2N2 в сочетании с генотипом А/А локуса 256A/G гена SLC6A3, являются валидной моделью не только для дальнейшего выяснения роли молекулярно-генетических факторов в формировании тревожно-депрессивных расстройств, но и для изучения их патогенеза, а также испытания действия анксиолитических препаратов.

Выявленное в работе изменение объемных хаpaктеристик базолатеральной группировки МК при повышенной тревожности является теоретическим базисом для исследования структурных хаpaктеристик этого образования мозга на современных нейровизуализационных аппаратах с целью разработки ранних диагностических критериев риска развития психических заболеваний, т.к. хорошо известно, что тревожность является первой реакцией организма на стресс [2].

 Авторы приносят благодарность заведующему отделом геномики человека Института биохимии и генетики УНЦ РАН заслуженному деятелю науки РФ, профессору, доктору биологических наук Хуснутдиновой Э.К., с.н.с. отдела Казанцевой А.В. за консультативную помощь, а также старшему лаборанту кафедры МФЧЖ Леушкиной Н.Ф. за помощь в проведении экспериментов.

---