СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВТОРИЧНЫХ СТРУКТУР ГЛЮКОАМИЛАЗ ИЗ ASPERGILLUS AWAMORI И SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1

• Авторы
• Резюме
• Файлы

Кожокина О.М. Ковалева Т.А. С помощью метода инфpaкрасной спектроскопии осуществлено сравнение вторичных структур глюкоамилаз из Aspergillus awamori и Saccharomyces cerevisiae. Получены данные о типах вторичной структуры, количественном соотношении упорядоченных и нерегулярных участков. Статья в формате PDF 250 KB

Исследование свойств глюкоамилаз различного происхождения приобретает особую значимость в связи с применением их в различных отраслях промышленности в роли биокатализаторов. Поиск путей регулирования биокаталитической активности ферментов неразрывно связан с расшифровкой закономерностей и молекулярного механизма катализа реакции гидролиза субстрата. Для решения данной задачи, наряду с определением функциональных свойств энзимов, необходимо проведение их структурного анализа.

Ранее нами были проведены исследования по установлению аминокислотного состава и осуществлен сравнительный анализ первичных структур глюкоамилаз из Aspergillus awamori X100 и Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7 [2, 3]. Определение типов и относительного количества элементов вторичной структуры является следующим этапом изучения прострaнcтвенной организации белковой молекулы. В настоящее время существует большое количество предсказательных методов, позволяющих априорно на основе анализа аминокислотных последовательностей прогнозировать итог процесса свертывания полипептидной цепи в глобулу [1, 6, 7]. Однако, анализ данных литературы показал, что с помощью имеющихся методов можно предсказывать правильную вторичную структуру лишь для двух третей всех остатков белка [1, 4, 6, 7]. Значительная погрешность расчетов и их сложность обусловливают целесообразность проведения прогнозирования в тех случаях, когда исследование данного уровня иерархии белковой молекулы нельзя осуществить иным, более корректным способом.

Регистрация спектров поглощения в инфpaкрасной области является одним из самых чувствительных методов изучения особенностей вторичной структуры белка.

С помощью метода инфpaкрасной спектроскопии (ИКС) нами было осуществлено сравнение вторичных структур глюкоамилаз из Aspergillus awamori X100 и Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7. Измерение величин светопропускания белковых образцов проводили на многофункциональном ИК-спектрофотометре SPECORD М-80 (Германия) в диапазоне 4000-400 см^-1. Обработку серии спектров проводили с учетом параметров всех реально существующих полос поглощения и их анализа.

Точность полученных данных контролировали как по средним квадратичным отклонениям, так и непосредственно по разности между спектрами, которая выводилась на график вместе с экспериментальными и модельными спектрами и полученными индивидуальными пиками.

Анализ ИК-спектров показал наличие полос поглощения амид I (1630-1660 см^-1) и амид II (1520-1550 см^-1), отличающихся для изучаемых ферментов лишь интенсивностью. Полоса амид I, обусловленная растяжением связи в карбонильной группе, указывает на наличие в молекулах глюкоамилаз различного происхождения структур с водородными связями и на присутствие неупорядоченных участков. Полоса амид II свидетельствует об одинаковом положении во вторичной структуре ферментов α-спиралей и β-структур. Колебания, порождающие ее, связаны с растяжением пептидных и деформацией водородных связей. Наличие пиков поглощения при 2860 и 2780 см^-1 соответствуют симметричным колебаниям метильных групп. На осуществление асимметричных колебаний карбоксильных групп указывает полоса поглощения при 2520 см^-1, а ряд пиков в области 1720-1872 см^-1 обусловлен колебаниями карбонильных групп в концевых ассоциированных СООН-группах. Кроме того, слабо проявляются полосы поглощения при 3373-3254 см^-1 , связанные с растяжением NH-связей. Пик в области 1000 см^-1 определяется наличием в структуре фенилаланина, гистидина и триптофана монозамещенного ароматического кольца.

Таблица 1. Параметры полос амид I и амид II для полипептидов и белков

Конформация	Амид I		Амид II
	Частота, см-1	Коэффициент экстинкции, моль-1см-1	Частота, см-1	Коэффициент экстинкции, моль-1см-1
α-спирали	1644-1649	750	1548-1553	340
β-структура	1615-1623 1691-1699	980 180	1530-1535 1563	340 100
Неупорядоченная структура	1650-1654	320	1546-1553	210

Анализ результатов, представленных в табл. 2, показал, что соотношение упорядоченных структур и нерегулярных участков в молекулах глюкоамилаз из Aspergillus awamori X100 и Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7 статистически не отличаются друг от друга.

Таблица 2. Содержание элементов вторичной структуры в молекулах глюкоамилаз из Aspergillus awamori X100 и Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7

Конформация	Глюкоамилаза из Aspergillus awamori			Глюкоамилаза из Saccharomyces cerevisiae
	ν, см-1	Т, %	%	ν, см-1	Т, %	%
α-спирали	1646	34	24,4	1646	56	24,1
β-структура	1620	32	18,3	1620	60	18,8
Неупорядоченные участки	1652	34	57,2	1652	59	57,1

Из данных литературы следует, что в глобулярных белках, трехмерные структуры которых определены методом рентгено-структурного анализа, обычно около 60 % остатков аминокислот участвуют в формировании вторичной структуры [1, 4-6]. Показано, что содержание α-спиралей в среднем составляет 35 %, β-структур - 15 %, реверсивных поворотов - 20-25 %. В связи с тем, что с помощью метода ИКС не удается определить количество изгибов полипептидной цепи, в таблице 2 представлены результаты расчета α-спиралей, β-слоев и нерегулярных участков. Так как α-спираль является наиболее часто встречающимся в белках типом вторичной структуры, можно сделать предположение о ее высокой конформационной стабильности. С этим хорошо согласуется информация о расположении α-спирали в центре разрешенной области на карте Рамачандрана, а также тот факт, что диполи ее водородных связей имеют линейное расположение, отвечающее минимуму энергии. Кроме того, радиус спирали благоприятствует дисперсионному притяжению между остатками, расположенными по разные стороны от оси спирали [6, 7].

Таким образом, на основании результатов наших исследований установлено, что в состав вторичной структуры молекул глюкоамилаз плесневого и дрожжевого происхождения входят все основные элементы: α-спирали, β-слои и неупорядоченные фрагменты. При этом β-структура анализируемых ферментов хаpaктеризуется наличием антипараллельных цепей. Выявлено, что заниженное по сравнению со среднестатистическим содержание α-спиралей компенсируется за счет увеличения количества β-слоев.

Список литературы

1. Кантор Ч. Биофизическая химия. - М.: Мир, 1984. - Т. 1. - 336 с.
2. Кожокина О.М., Ковалева Т.А. // Фундаментальные исследования. - 2009. - № 8. - С. 19.
3. Кожокина О.М., Ковалева Т.А. // Успехи современного естествознания. - 2010. - № 4. - С. 19.
4. Попов Е.М. Структурно-функциональная организация белков. - М.: Наука, 1992. - 358 с.
5. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. - М.: Высш. шк., 1996. - 335 с.
6. Шерман С.А. Конформационный анализ и установление прострaнcтвенной структуры белковых молекул. - Минск: Наука и техника, 1989. - 240 с.
7. Шульц Г. Принципы структурной организации белков. - М.: Мир, 1982. - 360 с.

---