ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ САПРОФИТНОЙ МИКРОФЛОРЫ С ВОЗБУДИТЕЛЯМИ САПРОЗООНОЗОВ В ПОЧВЕННЫХ БИОЦЕНОЗАХ

1

• Авторы
• Файлы
• Литература

Бузолева Л.С. 1 Ли Н.Г. 2 Сидоренко М.Л. 2

---

1 ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» СО РАМН2 ФГБУН БПИ ДВО РАН Статья в формате PDF 262 KB 1. Бузолева Л.С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды: автореф. дис. … д-ра биол. наук. – Владивосток, 2001. – 48 с. 2. Бухарин О.В., Семенов А.В., Черкасов С.В. Хаpaктеристика антагонистической активности пробиотических бактерий при их взаимодействии // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2010. – Т. 12. – № 4. – С. 347–352. 3. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Регуляторные функции экзометаболитов бактерий // Микробиология. – 2006. – Т. 75. – № 4. – С. 483. 4. Гершун В.И. Влияние абиотических факторов на жизнеспособность листерий в почве // Сиб.вестник с-х науки. – Новосибирск, 1980. – № 3. – С. 78–81. 5. Зуев В.С. Ветеринарная патология. – 2004. – № 4. – С. 11–16. 6. Кузнецов В.Г., Paковский В.В., Валекжанин Т.С., Сомов Г.П. Изучение эпидемиологии дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки в Приморском крае. Сообщение III. Выделение псевдотуберкулезного микроба из почвы и роль почвы в распространении инфекции // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 1976. – № 7. – С. 138–139. 7. Сидоренко М.Л., Бузолева Л.С. Влияние различных видов минеральных удобрений на размножение Listeria monocytogenes в почвах // Агрохимия. – 2008. – № 5. – С. 59–64. 8. Сидоренко М.Л., Бузолева Л.С. Хаpaктер взаимоотношений сапрофитной микрофлоры почв через газообразные метаболиты // Микробиология. – 2008. – Т. 77. – № 2. – С. 273–277. 9. Стародумова С.М., Зайцева Е.А. Серологический мониторинг листериозной инфекции у диких мышевидных грызунов в Приморском крае // Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии. – 2012. – № 20. – С. 84–86. 10. Терехова В.Е., Айздайчер Н.А., Бузолёва Л.С., Сомов Г.П. Влияние метаболитов морских микроводорослей на размножение бактерий вида Listeria monocytogenes // Биология моря. – 2009. – Т. 35. – № 4. – С. 306–309. 11. Тирранен Л.С., Ковров Б.Г., Черепанов О.А. Хаpaктер взаимодействия микроорганизмов через их газообразные метаболиты // Микробиология. – 1980. – Т. 49. – № 5. – C. 788–793.

Процесс существования патогенных бактерий в естественных экосистемах в настоящее время мало изучен. На самом деле автономное обитание в почве или воде многих патогенных бактерий и грибов, вызывающих инфекционные болезни человека и животных, закономерные и многообразные связи с почвенными и водными организмами делают их полноправными сочлeнами естественных экосистем, главным образом, почвенных и водных [5]. Listeria monocytogenes относится к возбудителям сапрозоонозов и обладает двойственной (сапрофитной и паразитической) природой, благодаря чему способна существовать как в эндотермных, так и в эктотермных организмах, растительных объектах, а также в почвенной и водной средах. Обитание L. monocytogenes в почве является известным фактом, что доказано как выделением возбудителей сапрозоонозов из этих субстратов [4, 6], так и в модельных экспериментах [1]. В настоящее время установлено, что на существование этих микроорганизмов в почвах оказывают влияние как абиотические факторы среды [7], так и биотические [8, 10].

Присутствие микроорганизмов в той или иной природной зоне определяется не только условиями внешней среды, но и наличием контроля со стороны других микроорганизмов. Многие исследователи [2, 3] считают, что соединения, продуцируемые микроорганизмами, могут действовать как внутри- или межвидовые регуляторы микробных сообществ. При этом отмечено как стимулирующее, так и ингибирующее действие веществ микробного происхождения на размножение микроорганизмов [8, 11].

Возможность того, что естественная микрофлора почвы может оказывать положительное влияние на сохранение патогенных микроорганизмов в почве, представляет особый интерес для исследований в этом направлении. В связи с этим, целью данной работы являлось изучение влияния сапрофитной микрофлоры почвы на размножение L. monocytogenes.

В работе использовали штаммы сапрофитных бактерий, выделенные нами из естественно сложившейся микробной ассоциации бурой лесной почвы, которая является природным очагом листериозной инфекции [9].

Всего было выделено из почвы 32 штамма сапрофитных бактерий, различных по своим культуральным свойствам. Идентификацию активных штаммов сапрофитных бактерий проводили с помощью физиолого-биохимических тестов и специфических праймеров в ПЦР-реакции.

Для экспериментальных исследований было использовано 10 эпидемически значимых штаммов L. monocytogenes, взятых из музея ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» СО РАМН, типичных по своим культуральным, серологическим и биохимическим свойствам.

Действие газообразных метаболитов испытуемых культур на рост тест-культур исследовали экспресс-методом Л.С. Тирранен (1980) в нашей модификации. Культура, действие летучих веществ которой изучали, далее именуется испытуемой, та, на которой проверялось это действие – тест-культурой. Все сапрофитные бактерии поочередно исследовались как испытуемые, все патогенные бактерии использовались только в качестве тест-культур. Воздействие испытуемой культуры на тест-культуру оценивали как положительное (стимулирующее) или отрицательное (ингибирующее), когда размер колоний тест-культур в опыте был соответственно увеличен или снижен на 20 % и более по сравнению с контролем. Действие испытуемой культуры оценивали как нулевое, если размер колоний в опыте отличался от контрольных не более чем на ±20 %. Контролем служили чашки Петри с тест-культурами, не подвергавшимися действию летучих продуктов жизнедеятельности испытуемых микроорганизмов. Результаты сравнения размеров колоний выражали в миллиметрах. Статистическую обработку данных проводили по Ф.Г. Лакину (1990). Учитывали среднюю арифметическую величину диаметра колоний, ошибку средней арифметической.

Наиболее активный штамм, отобранный с помощью экспресс-метода, в дальнейшем проверяли на активность экзометаболитов в жидкой среде (фосфатно-буферный раствор Петерсона-Кука, 0,1 % глюкоза, pH = 7,2). Динамику роста культуры листерий замеряли на спектрофотометре Т70 UV/VIS Spectrometer PG Instruments Ltd (Англия) при длине волны 590 нм. Наблюдение за ростом вели в течении 11 суток.

Поставленные эксперименты позволили оценить влияние летучих метаболитов сапрофитных бактерий на размножение листерий. Следует отметить, что большинство исследуемых сапрофитных штаммов в той или иной степени стимулировали рост листерий, по сравнению с контролем. Среди них 3 % – отрицательных (случаи, когда летучие метаболиты сапрофитных микроорганизмов подавляют рост испытуемой культуры патогенных бактерий), 90 % – положительных (случаи, когда летучие метаболиты стимулировали рост испытуемой микрофлоры), остальные результаты (7 % случаев) были нулевыми. Наблюдавшиеся в опытах нулевые взаимодействия могут являться слабыми положительными или отрицательными воздействиями, не учитываемыми данным методом исследования.

Наибольшее стимулирующее влияние на рост L. monocytogenes оказал штамм сапрофита, идентифицированный нами как Bacillus pumilus. Летучие метаболиты этого почвенного штамма стимулировали рост всех штаммов L. monocytogenes, взятых в эксперимент, по сравнению с контролем.

Одной из задач данного исследования было подобрать оптимальную концентрацию экзометаболитов B. pumilus в жидкой среде, обладающую максимальным стимулирующим эффектом в отношении роста листерий (штамм 6144 № 315). Для этого использовали рабочие концентрации экзометаболитов бацилл: 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 мл. Биологическое действие экзометаболитов выражали в процентах прироста биомассы по сравнению с контролем.

Следует отметить, что стимулирование роста культуры листерий наблюдали с максимумом на седьмые сутки для всех концентраций экзометаболитов сапрофита.

В результате эксперимента было показано, что экзометаболиты, взятые в концентрации 0,5 мл, в меньшей степени, чем все остальные концентрации, стимулировали рост листерий (на 30 % на седьмые сутки опыта). Стимулирование L. monocytogenes (штамм 6144 № 315) экзометаболитами сапрофита B. pumilus в концентрации 1,5 мл оказалось максимальным среди всех концентраций (на 123 % на седьмые сутки опыта).

Таким образом, установлено, что почвенные бактерии в микробных сообществах с L. monocytogenes, в большей степени стимулируют, чем угнетают рост патогенов. Стимуляция роста L. monocytogenes при взаимодействии с экзометаболитами штамма сапрофита, зависела от концентрации экзометаболитов, от биологических особенностей, как штамма сапрофита, так и штамма листерий. Подобрана наиболее оптимальная концентрация экзометаболитов B. pumilus – 1,5 мл, при которой отмечен максимальный стимулирующий эффект. Метаболиты, продуцируемые почвенной микрофлорой, могут действовать как регуляторы микробных сообществ. В частности, стимулирование роста и размножения L. monocytogenes может способствовать появлению эпидемических очагов, представляющих угрозу для человека.

---