ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ НЕФРОЛОГИЯ: СОЗДАНИЕ МОДЕЛИ АУТОИММУННОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА

1

• Авторы
• Файлы

Шишунова М.А. Тарасова О.И. Караева Г.Р. Коломеец Н.Ю. Статья в формате PDF 284 KB

Целью работы явилось создание модели мембранозного гломерулонефрита путем иммунизации белых беспородных (нелинейных) крыс I поколения суспензией почечного антигена, полученной от материнской особи. Эксперимент выполнен на 13 животных - самцах и самках белых беспородных (нелинейных) крыс. Иммунизацию проводили многократно внутрибрюшинно антигенной суспензией коркового слоя почки материнской особи в полном адъюванте Фрейнда без дополнительных раздражающих химических агентов из расчета 100 мкл суспензии на 100 граммов массы тела по схеме: 3-кратно 1 раз в сутки с интервалом иммунизации в 1 день и повторно однократно через 21 день. При последующем гистологическом исследовании препаратов почек иммунизированных животных наблюдалась морфологическая картина, соответствующая патоморфологическим изменениям, хаpaктерным для мембранозного гломерулонефрита. Воспроизводимость эксперимента составила 100 %.

Изучение структурных и ультраструктурных изменений нефрона при создании экспериментальных моделей нефрита преследует определенные цели: отработать на доклиническом уровне тактику и подходы к лечению гломерулонефрита в клинике, оценить терапевтический эффект новых нефропротективных препаратов [1, 2].

В экспериментальной нефрологии часто используется модель активного нефрита Хейманна, суть которой состоит в том, что экспериментальному животному вводиться антиген, полученный из эпителия щеточной каймы проксимальных кaнaльцев почек другого животного (крысы) [3, 4, 5, 6]. Нами разработана модельаутоиммунного гломерулонефрита, которая проводится без технических трудностей, со 100 % воспроизводимостью.

Материалы и методы. Эксперимент выполнен на 13 животных - самцах и самках беспородных белых крыс четырехмecячного возраста, содержащихся в стандартных условиях вивария: содержание в пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой, не более 10 особей в клетке, стандартный рацион и питьевой режим. Разброс в группах по исходной массе не превышал ± 10 %. Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. №755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.

Животные были разделены на 2 экспериментальных группы: I группа - контрольная (интактные животные), n = 6; II группа - животные, иммунизированные антигенной суспензией коркового слоя почки, n = 7.

Для получения антигенной суспезии брали самку белой беспородной крысы, массой 119,24 г, имеющую потомство 4-мecячного возраста. Сразу после декапитации животного, проведенной под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии, почки перфузировали insitu стерильной охлажденной средой 199 до получения равномерного серо-коричневого цвета. После этого их отсекали от почечной ножки и переносили на стерильный лоток. Все последующие манипуляции выполнялись при температуре +4 °С. Отделив от капсулы, почки разрезали сагитально, выделяли корковый слой (масса 2-х почек составила 980 мг, масса коркового слоя - 686 мг). Корковый слой суспендировали в стерильной ступке, дополнительно измельчали его в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т, в режиме 44 мГц, в течение 10 минут, затем переносили суспензию в центрифужный стаканчик и добавляли охлажденный физиологический раствор до 10 мл и 1 мг мертиолята в качестве антисептика. Полученную суспензию центрифугировали на холоде 3х кратно по 3 минуты 2 000 оборотов в минуту, каждый раз удаляли супернатант и доводили суспензию до 10 мл охлажденным физиологическим раствором. Затем суспензию центрифугировали еще раз при 5 000 оборотов в минуту в течение 10 минут, образовавшийся осадок осторожно переносили на стерильную фольгу, взвешивали на торсионных весах. Масса суспензионного осадка составила 360 мг. Полученный осадок состоял преимущественно из гломерул, которые хорошо визуализировались при микроскопии неокрашенных препаратов. Для приготовления антигенной суспензии брали 200 мг осадка и смешивали с 10 мл полного адъюванта Фрейнда (Disko-lab, USA) из расчета 1,0 мл на 20 мг осадка. Реагент представляет собой масляную эмульсию, содержащую дериваты ланолина (жирные кислоты), липополисахариды микобактерий туберкулеза, инактивированные высокой температурой, и используется для усиления иммунного ответа. Полученную взвешенную антигенную суспензию коркового слоя почки крысы хранили при температуре +4 °С.

Иммунизацию лабораторных животных проводили из расчета 100 мкл суспензии на 100 граммов массы тела по следующей схеме: 3-х кратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 1 день; повторно иммунизацию проводили через 3 недели внутрибрюшинно однократно в той же дозе.

Перед началом эксперимента у животных контрольной (интактной) и опытной группы проводили анализ разовой порции мочи на белок, используя качественную реакцию с 20 % сульфосалициловой кислотой. Через 1 день после иммунизации и затем через 3, 7, 14 дней повторяли контрольное исследование мочи на белок.

По окончании опыта животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забирали для проведения гистологического исследования. Материал фиксировали в нейтральном забуференном формалине, подвергали обезвоживанию в спиртах возрастающей крепости, заливали в парафин. Срезы получали на ротационном микротоме (толщина 3-4 мкм), окрашивали гематоксилином и эозином, нитратом серебра по Футу. Микроскопию препаратов в проходящем свете проводили с использованием светового микроскопа Micros (Австрия) при увеличении микроскопа ×60, ×150, ×600, ×1500.

Результаты и их обсуждение. У животных контрольной группы не было выявлено лабораторных и гистологических признаков развития гломерулонефрита. В течение всего эксперимента в моче животных этой группы белок не выявлялся.

При проведении гистологического исследования в почках четко выявлялась капсула, корковое вещество с почечными тельцами и извитыми кaнaльцами, мозговое вещество. Хорошо визуализировались мозговые лучи, глубоко вдающиеся в корковое вещество почки, сосочек и почечная лоханка, выстланная переходным эпителием. Прямые кaнaльцы в мозговом веществе и собирательные трубочки были без особенностей. Сосудистые клубочки не были изменены, мочевые прострaнcтва свободны, капсула Шумлянского-Боумена не утолщена. Между почечными тельцами находилисьпроксимальные и дистальные почечные кaнaльцы с типичной структурой. Сосудистая система почки была представлена междолевыми, дуговыми, междольковыми артериями и венами, капиллярами почечных телец (гломерул) с приносящими и выносящими артериолами, перитубулярными капиллярами. Дуговые артерии и вены располагались на границе коркового и мозгового вещества, в корковом веществе почки хорошо визуализировались междольковые артерии. Стенки сосудов имели типичное строение, не утолщены, эндотелий представлен одним слоем плоских клеток, лежащих на базальной мембране.

При проведении иммунизации у животных II группы наблюдали снижение диуреза и выраженную протеинурию, максимальную к 5-7 дню эксперимента.

При проведении гистологического исследования аутопсийного материала в ткани почек выявлялось полнокровие перитубулярных капилляров, дуговых и междольковых сосудов. В препаратах более чем в 60 % клубочков отмечалась мезангиальная пролиферация и увеличение клубочков в размерах, со значительным уменьшением мочевого прострaнcтва, отеком и утолщением париетального листка капсулы Шумлянского-Боумена, в ряде случаев с формированием клеточных полулуний. Так же отмечалось резкое утолщение, деструкция и деформация стенок клубочковых капилляров с образованием тромбов в просветах капилляров. В части клубочков при окрашивании серебром по Футу выявляли шипики на гломерулярной базальной мембране. В интерстиции и кaнaльцах почек наблюдался отек тканей, очаги воспаления и склероза. В проксимальных и дистальных кaнaльцах выражена атрофия эпителия с уплощением стенок, дистрофические изменения эпителия и наличие белковых цилиндров в просветах кaнaльцев.

Таким образом, в гистологических препаратах почек иммунизированных животных наблюдалась морфологическая картина соответствующая патоморфологическим изменениям, хаpaктерным для мембранозного гломерулонефрита. Воспроизводимость эксперимента составила 100 %.

Список литературы

1. Пальцева Е.М. Экспериментальные модели хронических заболеваний почек// Клиническая нефрология. - 2009. - №2. - С. 37-42.
2. Сивак К.В., Коваленко А.Л. Сравнительное изучение нефропротекторной активности верблюжьей колючки и цитофлавина // Вестник СПб ГМА им. И.И. Мечникова. - 2007. - №1. - С. 12-15.
3. Arai T. Ultrastructual background of albuminuria in rats with passive Heymann nephritis / T. Arai, K. Morimoto, H. Masaoka et al. // Nephrol. Dial. Transplant. - 1997. - Vol. 12. - P. 2542-2548.
4. Kerjaschki D. Neale Molecular mechanisms of glomerular injury in rat experimental membranous nephropathy (Heymann nephritis) / D. Kerjaschki, T.J. Neale // Journal of the American Society of Nephrology. - 1998. - Vol.7. - P. 2518-2526.
5. Shah P. Intramolecular Epitope Spreading in Heymann Nephritis / P. Shah, S. Tramontano, P. Makker // J. Am. Soc. Nephrol. - 2007. - Vol.18, № 12. - P. 3060-3066.
6. Tramontano A. Nested N-Terminal Megalin Fragments Induce High-Titer Autoantibody and Attenuated Heymann Nephritis / A. Tramontano, T. Knight, D. Vizzuso, S.P. Makker // J. Am. Soc. Nephrol. - 2006. - Vol. 17, № 7. - P. 1979-1985.

---