ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ ПРИМЕНЕНИЯ РЯДА ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ИНУЛИНАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ > Полезные советы
Тысяча полезных мелочей    

ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ ПРИМЕНЕНИЯ РЯДА ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ИНУЛИНАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ

ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ ПРИМЕНЕНИЯ РЯДА ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ИНУЛИНАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ

Ковалева Т.А. Холявка М.Г. Сапрыкина Н.И. Разработана методика получения высокоочищенных препаратов инулиназы из продуцентов Aspergillus awamori и Saccharomyces cerevisiae. Исследовано влияние различных органических растворителей на полноту осаждения данного фермента. Статья в формате PDF 208 KB инулиназаэтанолизопропанолацетон.

Инулиназы различного происхождения расщепляют инулин и другие фруктозосодержащие полимеры до фруктозы, воздействуя на гликозидные связи. Инулиназа (инулаза; 2,1-β-D-фруктан-фруктаногидролаза, КФ 3.2.1.7.) широко распространена среди высших растений и микроорганизмов. Данный фермент может применяться для получения фруктозы из растительного сырья: топинамбура, ге opгина, девясила, цикория, одуванчика, лопуха. Сиропы с высоким содержанием фруктозы, полученные путем ферментативного гидролиза экстpaктов инулинсодержащих растений, могут быть широко использованы в кондитерской промышленности, в лечебном питании больных сахарным диабетом, а также для профилактики кариеса и ожирения.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Объектами исследования послужили инулиназы из Aspergillus awamori 2250 и Saccharomyces cerevisiae ВГШ-2 (ВКПМ, Москва). В качестве субстрата для ферментативной реакции применяли инулин (Spofa, Прага).

Фермент экстрагировали из высушенной и измельченной культуры продуцента при 20-25 °С в течение 1,5 ч. Осаждение инулиназ проводили при температуре -4 °С и значении рН 4,0, полученный осадок отделяли центрифугированием, высушивали на воздухе и взвешивали. Содержание белка определяли методом Лоури [5], каталитическую активность измеряли спектрофотометрически на фотоэлектроколориметре КФК-3 (Россия) при помощи реакции Селиванова [2].

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью пакета программ «Statgraphics». Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В этой работе нами было изучено влияние различных концентраций этанола и ацетона на эффективность осаждения инулиназы Aspergillus awamori и различных концентраций ацетона и изопропанола на степень очистки инулиназы Saccharomyces cerevisiae. Данные экспериментов (рис. 1 и 2) свидетельствуют о том, что использование этанола и ацетона в диапазоне концентраций 50 %-80 % по-разному отражается на выходе инулиназы Aspergillus awamori и эффективности ее очистки. Максимальный выход фермента наблюдается при концентрации ацетона 65 % и составляет 85 %, что на 5 % больше этой же величины, чем при осаждении этанолом. Более низкие концентрации данного растворителя (50 %), хотя и сохраняют большую активность инулиназы (до 13 ед/мг), но выход энзима при этом оказывается ниже. Более высокие концентрации ацетона (80 %) резко уменьшают ферментативную активность. Таким образом, оптимальной концентрацией ацетона для осаждения инулиназы из поверхностной культуры Aspergillus awamori является 65 %, в этом случае выход фермента и эффективность очистки максимальны.

В следующей серии экспериментов мы исследовали влияние этанола в различных концентрациях на процесс очистки инулиназы Aspergillus awamori. Оказалось, что для осаждения фермента этанолом требуется большая концентрация спирта - 75 %. При этом эффективность очистки максимальна, выход фермента составляет 81 %, а удельная активность оказывается на 7 % ниже этой же величины, чем при использовании оптимальной концентрации ацетона.

Анализируя полученные результаты, мы пришли к выводу, что использование ацетона в концентрации 65 % является наиболее эффективным, рациональным и экономичным. Ацетон обладает меньшим денатурирующим действием, чем этанол, отчасти потому, что требуются более низкие его концентрации для получения фермента. Кроме того, ацетон более летуч, что позволяет легко удалять его из полученного препарата, к тому же он оказывает стабилизирующее действие на белковую молекулу фермента.

Рис. 1. Влияние различных концентраций ацетона на очистку инулиназы Aspergillus awamori

Рис. 2. Влияние различных концентраций этанола на очистку инулиназы Aspergillus awamori

Литературные данные указывают на то, что концентрация ионов водорода в среде может влиять на процесс осаждения ферментов органическими растворителями [1, 3]. В связи с этим, следующая серия экспериментов была посвящена изучению влияния различных значений pH на каталитическую активность инулиназы и степень ее очистки в ходе осаждения ацетоном оптимальной концентрации из поверхностной культуры Aspergillus awamori (рис. 3).

Рис. 3. Влияние различных значений pH на активность инулиназы Aspergillus awamori при осаждении ее ацетоном

Показано, что для выпадение инулиназы в осадок из раствора наиболее перспективным является значение pH 4,0. Данная концентрация ионов водорода, по-видимому, близка к изоэлектрической точке инулиназы из Aspergillus awamori. Известно, что почти все глобулярные белки при значении pH раствора, близком к их изоэлектрической точке, обладают меньшей растворимостью [4], так как в этом случае молекула не несет суммарного заряда и, следовательно, между соседними белковыми глобулами отсутствует электростатическое отталкивание. Поскольку белки, имеющие различные изоэлектрические точки, осаждаются при различных концентрациях ионов водорода в среде, используя оптимальное для осаждения инулиназы значение pH, можно успешно освобождаться от сопутствующих белков в ходе очистки.

Рис. 4. Влияние различных концентраций изопропанола на очистку инулиназы Saccharomyces cerevisiae

Наши исследования показали, что обоими органическими растворителями инулиназа Saccharomyces cerevisiae осаждалась монотонно с последовательным увеличением их концентрации. На рис. 4 и 5 представлены данные о влиянии концентрации изопропанола и ацетона на осаждение инулиназы.

Рис. 5. Влияние различных концентраций ацетона на очистку инулиназы Saccharomyces cerevisiae

Показано, что лучшим осадителем для инулиназы Saccharomyces cerevisiae является изопропанол при содержании его в смеси в объемных соотношениях 1:3,5. В этом случае выход фермента составил 96,7 % при степени очистки 2,21. Самая высокая удельная активность энзима (9,54 ед/мг) получена при концентрации изопропанола 1:4, выход фермента в этом случае достигал 86,4 %.

Максимально возможный выход инулиназы, полученный при использовании ацетона в соотношении 1 объем растворителя на 3 объема экстpaкта составил 86,9 % при степени очистки 1,14.

Таким образом, анализ полученных результатов позволил заключить, что для получения технического препарата инулиназы из продуцентов Aspergillus awamori и Saccharomyces cerevisiae можно успешно использовать любой из указанных органических растворителей (этанол, изопропанол, ацетон) в оптимальных концентрациях.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

  1. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982. Т. 1-3. 1118 с.
  2. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат, 1987. 429 с.
  3. Тертычная Т. Н. Исследование биосинтеза и некоторых физико-химических свойств инулазы: автореф. дис. канд. биол. наук. ВорГУ. Воронеж, 1994. 24 с.
  4. Уильямс В., Уильямс Х. Физическая химия для биологов. М.: Мир, 1976. 600 с.
  5. Lowry O.N., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. // J. Biol. Chem., 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.


КЛАСТЕРНАЯ ТЕОРИЯ ТЕПЛОЕМКОСТИ ГАЗОВ

КЛАСТЕРНАЯ ТЕОРИЯ ТЕПЛОЕМКОСТИ ГАЗОВ Статья в формате PDF 128 KB...

03 02 2023 7:39:59

ВЛИЯНИЕ ГИДРОЭЛЕКТРОСТАНЦИЙ НА ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУ

ВЛИЯНИЕ ГИДРОЭЛЕКТРОСТАНЦИЙ НА ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУ Статья в формате PDF 267 KB...

01 02 2023 19:37:44

ГРАНИЦЫ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО ПРОСТРАНСТВА

ГРАНИЦЫ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО ПРОСТРАНСТВА В представленной статье дается попытка разграничения понятия «образовательное прострaнcтво» на основе анализа имеющихся дефиниций и примере формирования целостного образовательного прострaнcтва в профессиональном образовательном учреждении, интегрирующем его начальный, средний и высший уровни. ...

31 01 2023 11:20:19

БИОВОЛНОГЕНЕЗ: Ч.1. СТИХИЙНЫЕ БЕДСТВИЯ

БИОВОЛНОГЕНЕЗ: Ч.1. СТИХИЙНЫЕ БЕДСТВИЯ Статья в формате PDF 133 KB...

28 01 2023 18:40:37

ВЕРХНЕОЛИГОЦЕН-НИЖНЕМИОЦЕНОВЫЙ АЛЛЮВИЙ В ПАЛЕОДОЛИНАХ ЗАПАДНЫХ ПРЕДГОРИЙ АЛТАЯ И ЛАНДШАФТНО-КЛИМАТИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ ЕГО НАКОПЛЕНИЯ

ВЕРХНЕОЛИГОЦЕН-НИЖНЕМИОЦЕНОВЫЙ АЛЛЮВИЙ В ПАЛЕОДОЛИНАХ ЗАПАДНЫХ ПРЕДГОРИЙ АЛТАЯ И ЛАНДШАФТНО-КЛИМАТИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ ЕГО НАКОПЛЕНИЯ В западных предгорьях Алтая скважинами вскрыты погребенные долины, выполненные верхнеолигоцен-нижнемиоценовым аллювием. Литологические, минералогические, геохимические особенности этих отложений и спорово-пыльцевые спектры свидетельствуют об их накоплении, и формировании долин в условиях влажного умеренно теплого климата со среднегодовыми положительными температурами не ниже +3 °С и годовым количеством осадков не менее 800 мм. В это время здесь, в ныне самом засушливом районе Алтая со среднегодовым количеством осадков 200 мм, были развиты ландшафты хвойно-широколиственных и листопадных лесов тургайского типа с участием отдельных теплолюбивых субтропических элементов. ...

24 01 2023 2:31:37

ФАКТОРЫ РИСКА РАЗВИТИЯ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНЫХ СПОСОБНОСТЕЙ ОДАРЁННЫХ ДЕТЕЙ

ФАКТОРЫ РИСКА РАЗВИТИЯ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНЫХ СПОСОБНОСТЕЙ ОДАРЁННЫХ  ДЕТЕЙ В рамках решения задачи развития интеллектуальных способностей одарённых детей сегодня отчётливо просматриваются факторы риска. Значимыми факторами риска являются неудовлетворение потребностей определённых групп детей в питании, распространение среди подрастающего поколения вредных привычек, стресс, изменяющиеся условия окружающей природной среды. ...

23 01 2023 21:27:10

КАРДИОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПАРАФАРМАЦЕВТИКА ЛОНГОЛАЙФ-IBMED ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА

КАРДИОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПАРАФАРМАЦЕВТИКА ЛОНГОЛАЙФ-IBMED ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА На модели экспериментального инфаркта миокарда у крыс на фоне введения препарата лонголайф-IBMED изучены изменения ЭКГ и частоты сердечных сокращений (через 1 час и через 7 суток). Показано, что испытуемый препарат обладает противоишемическим действием, улучшает коронарный кровоток в постинфарктный период, достоверно повышает выживаемость животных. ...

19 01 2023 21:45:35

ПРИМЕНЕНИЕ СВЕРХПРОВОДНИКОВ В ЭНЕРГЕТИКЕ

ПРИМЕНЕНИЕ СВЕРХПРОВОДНИКОВ В ЭНЕРГЕТИКЕ Статья в формате PDF 267 KB...

17 01 2023 0:50:17

ЗАВИСИМОСТЬ ПСИХОТРОПНЫХ ЭФФЕКТОВ АЦЕТИЛСАЛИЦИЛАТОВ ОТ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

ЗАВИСИМОСТЬ ПСИХОТРОПНЫХ ЭФФЕКТОВ АЦЕТИЛСАЛИЦИЛАТОВ ОТ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ В экспериментальных стресс-моделях на крысах при использовании блокатора D2–рецепторов галоперидолом, исследовался уровень участия дофаминергической системы мозга и зависимость психотропных эффектов аспирина, ацетилсалицилатов цинка (АСЦ) и кобальта (АСК). В ходе работы был получен весомый аргумент в пользу того, что антидепрессантный эффект исследованных салицилатов в значительной мере реализуется через дофаминергическую систему мозга. ...

09 01 2023 15:12:48

БОРЬБА С КОРРУПЦИЕЙ: УРОКИ ИСТОРИИ

БОРЬБА С КОРРУПЦИЕЙ: УРОКИ ИСТОРИИ Статья в формате PDF 268 KB...

03 01 2023 9:15:40

ТЕРРИТОРИАЛЬНЫЙ ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ БАЛАНС

ТЕРРИТОРИАЛЬНЫЙ ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ БАЛАНС Статья в формате PDF 273 KB...

24 12 2022 12:16:38

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОЛЩИНЫ СМАЗОЧНОЙ ПЛЕНКИ В ЗОНЕ КОНТАКТА АБРАЗИВНЫХ ЗЕРЕН ПРИ ОБРАБОТКЕ ДЕТАЛЕЙ УПЛОТНЕННЫМ АБРАЗИВОМ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОЛЩИНЫ СМАЗОЧНОЙ ПЛЕНКИ В ЗОНЕ КОНТАКТА АБРАЗИВНЫХ ЗЕРЕН ПРИ ОБРАБОТКЕ ДЕТАЛЕЙ УПЛОТНЕННЫМ АБРАЗИВОМ В статье приведены результаты исследований величин защитных пленок смaзoчно-охлаждающей жидкости (СОЖ) при обработке деталей уплотненным абразивом. При исследовании толщины адсорбционной пленки адсорбцию выражали через молярно – объемные концентрации поверхностно-активных веществ (ПАВ) в растворе абразивной суспензии до и после обработки на экспериментальном стенде камерного типа. Полученные значения величин защитных пленок, необходимы для оценки интенсивности обработки поверхности детали выступами микрорельефа абразивного зерна. ...

17 12 2022 5:40:52

Еще:
Поддержать себя -1 :: Поддержать себя -2 :: Поддержать себя -3 :: Поддержать себя -4 :: Поддержать себя -5 :: Поддержать себя -6 :: Поддержать себя -7 :: Поддержать себя -8 :: Поддержать себя -9 :: Поддержать себя -10 :: Поддержать себя -11 :: Поддержать себя -12 :: Поддержать себя -13 :: Поддержать себя -14 :: Поддержать себя -15 :: Поддержать себя -16 :: Поддержать себя -17 :: Поддержать себя -18 :: Поддержать себя -19 :: Поддержать себя -20 :: Поддержать себя -21 :: Поддержать себя -22 :: Поддержать себя -23 :: Поддержать себя -24 :: Поддержать себя -25 :: Поддержать себя -26 :: Поддержать себя -27 :: Поддержать себя -28 :: Поддержать себя -29 :: Поддержать себя -30 :: Поддержать себя -31 :: Поддержать себя -32 :: Поддержать себя -33 :: Поддержать себя -34 :: Поддержать себя -35 :: Поддержать себя -36 :: Поддержать себя -37 :: Поддержать себя -38 ::