ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ ПРИМЕНЕНИЯ РЯДА ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ИНУЛИНАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ
Инулиназы различного происхождения расщепляют инулин и другие фруктозосодержащие полимеры до фруктозы, воздействуя на гликозидные связи. Инулиназа (инулаза; 2,1-β-D-фруктан-фруктаногидролаза, КФ 3.2.1.7.) широко распространена среди высших растений и микроорганизмов. Данный фермент может применяться для получения фруктозы из растительного сырья: топинамбура, ге opгина, девясила, цикория, одуванчика, лопуха. Сиропы с высоким содержанием фруктозы, полученные путем ферментативного гидролиза экстpaктов инулинсодержащих растений, могут быть широко использованы в кондитерской промышленности, в лечебном питании больных сахарным диабетом, а также для профилактики кариеса и ожирения.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Объектами исследования послужили инулиназы из Aspergillus awamori 2250 и Saccharomyces cerevisiae ВГШ-2 (ВКПМ, Москва). В качестве субстрата для ферментативной реакции применяли инулин (Spofa, Прага).
Фермент экстрагировали из высушенной и измельченной культуры продуцента при 20-25 °С в течение 1,5 ч. Осаждение инулиназ проводили при температуре -4 °С и значении рН 4,0, полученный осадок отделяли центрифугированием, высушивали на воздухе и взвешивали. Содержание белка определяли методом Лоури [5], каталитическую активность измеряли спектрофотометрически на фотоэлектроколориметре КФК-3 (Россия) при помощи реакции Селиванова [2].
Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью пакета программ «Statgraphics». Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В этой работе нами было изучено влияние различных концентраций этанола и ацетона на эффективность осаждения инулиназы Aspergillus awamori и различных концентраций ацетона и изопропанола на степень очистки инулиназы Saccharomyces cerevisiae. Данные экспериментов (рис. 1 и 2) свидетельствуют о том, что использование этанола и ацетона в диапазоне концентраций 50 %-80 % по-разному отражается на выходе инулиназы Aspergillus awamori и эффективности ее очистки. Максимальный выход фермента наблюдается при концентрации ацетона 65 % и составляет 85 %, что на 5 % больше этой же величины, чем при осаждении этанолом. Более низкие концентрации данного растворителя (50 %), хотя и сохраняют большую активность инулиназы (до 13 ед/мг), но выход энзима при этом оказывается ниже. Более высокие концентрации ацетона (80 %) резко уменьшают ферментативную активность. Таким образом, оптимальной концентрацией ацетона для осаждения инулиназы из поверхностной культуры Aspergillus awamori является 65 %, в этом случае выход фермента и эффективность очистки максимальны.
В следующей серии экспериментов мы исследовали влияние этанола в различных концентрациях на процесс очистки инулиназы Aspergillus awamori. Оказалось, что для осаждения фермента этанолом требуется большая концентрация спирта - 75 %. При этом эффективность очистки максимальна, выход фермента составляет 81 %, а удельная активность оказывается на 7 % ниже этой же величины, чем при использовании оптимальной концентрации ацетона.
Анализируя полученные результаты, мы пришли к выводу, что использование ацетона в концентрации 65 % является наиболее эффективным, рациональным и экономичным. Ацетон обладает меньшим денатурирующим действием, чем этанол, отчасти потому, что требуются более низкие его концентрации для получения фермента. Кроме того, ацетон более летуч, что позволяет легко удалять его из полученного препарата, к тому же он оказывает стабилизирующее действие на белковую молекулу фермента.
Рис. 1. Влияние различных концентраций ацетона на очистку инулиназы Aspergillus awamori
Рис. 2. Влияние различных концентраций этанола на очистку инулиназы Aspergillus awamori
Литературные данные указывают на то, что концентрация ионов водорода в среде может влиять на процесс осаждения ферментов органическими растворителями [1, 3]. В связи с этим, следующая серия экспериментов была посвящена изучению влияния различных значений pH на каталитическую активность инулиназы и степень ее очистки в ходе осаждения ацетоном оптимальной концентрации из поверхностной культуры Aspergillus awamori (рис. 3).
Рис. 3. Влияние различных значений pH на активность инулиназы Aspergillus awamori при осаждении ее ацетоном
Показано, что для выпадение инулиназы в осадок из раствора наиболее перспективным является значение pH 4,0. Данная концентрация ионов водорода, по-видимому, близка к изоэлектрической точке инулиназы из Aspergillus awamori. Известно, что почти все глобулярные белки при значении pH раствора, близком к их изоэлектрической точке, обладают меньшей растворимостью [4], так как в этом случае молекула не несет суммарного заряда и, следовательно, между соседними белковыми глобулами отсутствует электростатическое отталкивание. Поскольку белки, имеющие различные изоэлектрические точки, осаждаются при различных концентрациях ионов водорода в среде, используя оптимальное для осаждения инулиназы значение pH, можно успешно освобождаться от сопутствующих белков в ходе очистки.
Рис. 4. Влияние различных концентраций изопропанола на очистку инулиназы Saccharomyces cerevisiae
Наши исследования показали, что обоими органическими растворителями инулиназа Saccharomyces cerevisiae осаждалась монотонно с последовательным увеличением их концентрации. На рис. 4 и 5 представлены данные о влиянии концентрации изопропанола и ацетона на осаждение инулиназы.
Рис. 5. Влияние различных концентраций ацетона на очистку инулиназы Saccharomyces cerevisiae
Показано, что лучшим осадителем для инулиназы Saccharomyces cerevisiae является изопропанол при содержании его в смеси в объемных соотношениях 1:3,5. В этом случае выход фермента составил 96,7 % при степени очистки 2,21. Самая высокая удельная активность энзима (9,54 ед/мг) получена при концентрации изопропанола 1:4, выход фермента в этом случае достигал 86,4 %.
Максимально возможный выход инулиназы, полученный при использовании ацетона в соотношении 1 объем растворителя на 3 объема экстpaкта составил 86,9 % при степени очистки 1,14.
Таким образом, анализ полученных результатов позволил заключить, что для получения технического препарата инулиназы из продуцентов Aspergillus awamori и Saccharomyces cerevisiae можно успешно использовать любой из указанных органических растворителей (этанол, изопропанол, ацетон) в оптимальных концентрациях.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
- Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982. Т. 1-3. 1118 с.
- Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат, 1987. 429 с.
- Тертычная Т. Н. Исследование биосинтеза и некоторых физико-химических свойств инулазы: автореф. дис. канд. биол. наук. ВорГУ. Воронеж, 1994. 24 с.
- Уильямс В., Уильямс Х. Физическая химия для биологов. М.: Мир, 1976. 600 с.
- Lowry O.N., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. // J. Biol. Chem., 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.
Статья в формате PDF
216 KB...
05 06 2023 17:18:57
Статья в формате PDF
257 KB...
04 06 2023 14:52:28
Статья в формате PDF
307 KB...
01 06 2023 19:32:27
Статья в формате PDF
120 KB...
31 05 2023 9:47:52
Статья в формате PDF
124 KB...
30 05 2023 3:55:31
Статья в формате PDF
560 KB...
29 05 2023 0:35:21
Статья в формате PDF
115 KB...
28 05 2023 6:54:58
Статья в формате PDF
133 KB...
27 05 2023 13:34:59
Рассматриваются показатели всхожести семян и частота встречаемости патологий митоза проростков лука-батуна (Allium fistulosum. L.), выращенных на почвенных пробах, отобранных на территории Западной Якутии в природных биотопах и в зоне воздействия предприятий горнодобывающей промышленности. Проанализировано 97 проб почвы, 35 000 клеток. Выявлено снижение всхожести семян и повышение показателя мутагенной активности почв на территории, загрязненной в результате деятельности алмaзoдобывающей промышленности и разведки месторождений углеводородного сырья в зоне воздействия всех обследованных предприятий. Это свидетельствует о нарушении цитогенетического гомеостаза вследствие комплексного воздействия негативных факторов антропогенно преобразованной среды.
...
26 05 2023 20:46:38
Построена октетная электродинамика. Обсуждена возможность объединения механики и электродинамики. Выявлена дальнодействующая структуризация октетного прострaнcтва. Исследуются свойства интервала.
...
25 05 2023 11:15:23
Статья в формате PDF
351 KB...
24 05 2023 0:38:25
Статья в формате PDF
287 KB...
23 05 2023 10:23:31
Статья в формате PDF
253 KB...
22 05 2023 14:32:27
Статья в формате PDF
110 KB...
20 05 2023 3:48:46
Статья в формате PDF
131 KB...
19 05 2023 14:35:46
18 05 2023 6:21:47
Изучены особенности биологии и некоторые демографические хаpaктеристики двух популяций озерной лягушки (Rana ridibunda Pall.), случайно интродуцированной в водоемы-охладители тепловых станций, на территории Среднего Урала. Условия существования в новых водоемах оказались благоприятными. За интродукцией последовало самостоятельное расселение, обе популяции в настоящее время занимают значительную территорию. Животные, обитающие в этих популяциях, отличаются по размерно-возрастному составу размножающихся особей, типу нереста, плодовитости. Полученные данные позволяют утверждать, что обнаруженные различия носят адаптивный хаpaктер.
...
17 05 2023 4:54:21
Статья в формате PDF
141 KB...
16 05 2023 15:38:26
Статья в формате PDF
301 KB...
15 05 2023 13:23:26
Статья в формате PDF
118 KB...
12 05 2023 8:38:17
Статья в формате PDF
315 KB...
11 05 2023 12:36:13
Статья в формате PDF
112 KB...
10 05 2023 11:23:52
Статья в формате PDF
134 KB...
09 05 2023 23:53:15
Статья в формате PDF
300 KB...
08 05 2023 18:29:22
Статья в формате PDF
251 KB...
07 05 2023 22:41:59
Статья в формате PDF
232 KB...
05 05 2023 1:20:33
Статья в формате PDF
350 KB...
04 05 2023 23:14:17
Статья в формате PDF
111 KB...
03 05 2023 14:22:51
Статья в формате PDF
286 KB...
02 05 2023 19:39:42
Статья в формате PDF
244 KB...
30 04 2023 4:36:52
Статья в формате PDF
126 KB...
29 04 2023 0:34:41
Статья в формате PDF
130 KB...
28 04 2023 4:51:22
Статья в формате PDF
104 KB...
27 04 2023 14:10:57
Статья в формате PDF
111 KB...
26 04 2023 7:19:43
Статья в формате PDF
104 KB...
25 04 2023 20:35:16
Статья в формате PDF
109 KB...
24 04 2023 2:39:22
Статья в формате PDF
256 KB...
21 04 2023 18:35:47
Статья в формате PDF
119 KB...
20 04 2023 4:54:26
Статья в формате PDF
139 KB...
19 04 2023 12:35:40
Статья в формате PDF
113 KB...
18 04 2023 14:11:22
Еще:
Поддержать себя -1 :: Поддержать себя -2 :: Поддержать себя -3 :: Поддержать себя -4 :: Поддержать себя -5 :: Поддержать себя -6 :: Поддержать себя -7 :: Поддержать себя -8 :: Поддержать себя -9 :: Поддержать себя -10 :: Поддержать себя -11 :: Поддержать себя -12 :: Поддержать себя -13 :: Поддержать себя -14 :: Поддержать себя -15 :: Поддержать себя -16 :: Поддержать себя -17 :: Поддержать себя -18 :: Поддержать себя -19 :: Поддержать себя -20 :: Поддержать себя -21 :: Поддержать себя -22 :: Поддержать себя -23 :: Поддержать себя -24 :: Поддержать себя -25 :: Поддержать себя -26 :: Поддержать себя -27 :: Поддержать себя -28 :: Поддержать себя -29 :: Поддержать себя -30 :: Поддержать себя -31 :: Поддержать себя -32 :: Поддержать себя -33 :: Поддержать себя -34 :: Поддержать себя -35 :: Поддержать себя -36 :: Поддержать себя -37 :: Поддержать себя -38 ::