ИССЛЕДОВАНИЕ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ПРОТЕИН-ПОЛИСАХАРИДНЫХ ГЕЛЯХ МЕТОДОМ Н+ЯМР-РЕЛАКСАЦИИ

1

• Авторы
• Резюме
• Файлы

Я.И.Коренман Н.С.Родионова Методом Н+ЯМР-релаксации изучены межмолекулярные взаимодействия в гелях крахмала в молочной среде. Установлены зависимости скоростей поперечной и продольной релаксаций протонов от концентрации крахмала для водных и молочных систем. Казеин синергетически влияет на гелеобразующую способность крахмала, который иммобилизует воду в молочной среде более активно, чем в водной. На основании исследований температурной зависимости поперечной релаксации доказано образование комплексного геля, представляющего собой сетку из спиральных молекул крахмала, в ячейки которой включены мицеллы и субмицеллы казеина. Статья в формате PDF 141 KB

Гели, твердообразные дисперсные системы с высоким содержанием влаги, широко применяются в косметической, фармацевтической и пищевой промышленности. Значительная часть косметических и лекарственных пре­паратов, продуктов питания имеет гелевую структуру. Гелеобразование происходит в результате действия стабилизаторов, связывающих воду и обра­зующих за счет связей нефлуктуационной природы прострaнcтвенную сетку, которая пронизывает весь объем системы и удерживает растворитель. К ста­билизирующим ингредиентам относятся протеины и полисахариды - природ­ные биополимеры, молекулы которых дифильны и образуют структуру с по­вторяющимися лиофильными и лиофобными участками.

Действие стабилизаторов обусловлено конформационным уплотнением макромолекулярных структур (утолщающий эффект) и специфичным меж­цепочным взаимодействием в узловых зонах (структурный эффект). В ре­зультате действия указанных факторов в системе значительно изменяются вязкость, предельное напряжение сдвига, время релаксации протонов, фикси­руемые методами вискозиметрии [1]. Следует также учесть, что свойства во­ды, как дисперсионной среды, удерживаемой в геле, и свободной воды раз­личны. Связанную воду классифицируют на три категории - воду, связанную с полярными центрами, кластерную воду и гидрофобную. Одной из хаpaкте­ристик гель-связанной воды является уменьшение ее подвижности, фикси­руемое методом Н⁺ЯМР-релаксации [2-6].

Цель работы cостоит в изучении конформационных изменений и межце­почных взаимодействий в протеин-полисахаридных системах на основе ана­лиза релаксационных явлений крахмал-казеиновых гелей (казеин - основной белок молока), образуемых при введении крахмала в обезжиренное молоко. Для установления влияния казеина на гелеобразующую способность крахма­ла в качестве контроля применяли водно-крахмальные растворы при соот­ветствующих концентрациях полисахарида.

Крахмал состоит из двух полисахаридов - амилозы и амилопектина, образо­ванных остатками глюкозы. Амилоза растворима, амилопектин - нераство­римая часть крахмала, образующая гель. Макромолекула амилозы имеет ли­нейную структуру, состоящую из остатков α-Д-глюкопиранозы, соединен­ных α-1,4-гликозидными связями и свернутую в спираль, причем на один виток спирали приходится 6 пиранозных фрагментов. Спираль стабилизиро­вана водородными связями между СНОН- и ОН- группами при   С (2).

Амилопектин состоит из остатков α- Д - глюкозы, связанных

α - 1-4-гликозидными связями. Основная цепь содержит кластеры a-1,6 связанных глюкозных остатков. В геометрическом отношении макромолеку­ла амилопектина имеет разветвленную структуру. Связи С-О по обе стороны пиранозного кольца непараллельны; связь при С(1) аксиальная, при С(4) экваториальная. В результате упорядоченной конформацией цепи (вторичная структура полисахарида) является спираль [7,8]. Для крахмала хаpaктерна третичная структура - двойная спираль типа НН - две «вкрученные» друг в друга спирали с общей осью. Четвертичная структура представляет собой объединение третичных структур с образованием клубка. Молекулярная масса крахмала, найденная нами методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [9] (хроматограф 1090 М фирмы Хъюлетт-Паккард), состав­ляет 87 - 131 кD. Содержание крахмала в водной и молочной средах изменя­лось в диапазоне 1 - 15 мас.%.

Белки молока имеют глобулярную структуру, представлены казеинами α-,β- ,Χ- и γ- (2,4 - 3,0 мас.%), а также сывороточными белками -

β-лактоглобулином (0,2 - 0,4 мас.%) и a-лактоальбумином (0,06 - 0,17 мас.%). Основной протеин молока (α-казеин) состоит из 4 фpaкций, отли­чающихся электрофоретической подвижностью, молекулярной массой, со­ставом и последовательностью аминокислот в полипептидной цепи. Состоящая из аминокислот полипептидная цепь (первичная структура белка) обра­зует спираль (вторичная структура) вследствие взаимодействия заряженных групп аминокислот. При реализации водородных связей между отдельными кольцами спирали макромолекула принимает форму клубка - глобулы (суб­мицеллы) с ориентацией гидрофобных групп к ее внутренней части, гидро­фильных - к внешней. Субмицеллы объединяются в мицеллы при участии коллоидного фосфата кальция, причем внешний слой мицеллы состоит пре­имущественно из c- казеина, представляющего собой гликопротеид, ориен­тированный гликозидной группой к водной дисперсионной среде.

Таким образом, глобулярные белки хаpaктеризуются следующими общими признаками: компактной формой, близкой к сферической, расположенной во внутренней части глобулы информацией о первичной структуре белка и гид­рофильными группами на поверхности макромолекулы, которая является полиионом. В изученных нами гетерогенных системах a-казеин находится в виде казеинат-кальций-фосфатного комплекса, ассоциирован в мицеллы диа­метром 130 - 160 нм со средней молекулярной массой до10⁸ .

Измерения методом Н⁺ЯМР выполняли на импульсном спектрометре низко­го разрешения «Протон-20», диапазон изменения температур 10 - 40^оС. Зави­симость спада протонной поперечной релаксации от времени, а также ее за­селенности изучали при импульсной последовательности CPMG (τ = 1,0 и 2,0 млс, время повторных запусков 4 с, число накоплений 9); зависимость вос­становления продольной релаксации и ее заселенности от времени - при им­пульсной последовательности 90^оС-τ- 90^оС [10].

Экспериментальные релаксационные кривые спадов поперечной намагни­ченности (А) во времени для водно-крахмальных и молочно-крахмальных систем в полулогарифмических координатах имеют экспоненциальный ха­paктер, на релаксационных кривых перегиб отсутствует (рис.1). Время продольной и поперечной релаксаций (Т₁, Т₂) рассчитывали с применением модели одно-экспоненциального спада (табл.1).

Рис.1. Спады поперечной намагниченности образцов крахмальных гелей на основе обезжиренного молока при содержании крахмала (мас. %): 0 (1); 5,0 (2); 10 (3), 15,0 (4).

Таблица 1. Значения продольной (Т₁) и поперечной (Т₂) релаксаций, их заселенность для крахмалсодержащих систем, 20 ⁰С

Образец	Т2 ,млс	Т1 , млс	R2 , c-1	R1 , c-1
Цельное молоко без крахмала	193,1	1275,0	5,2	0,8
Молочно-крахмальная система (15 % мас. крахмала)	71,0	319,0	14,1	3,1
Водно- крахмальная система (15% мас.крахмала)	223,0	627,0	4,5	1,6
Молочно- крахмальная система (10% мас.крахмала)	90,9	382,0	11,0	2,6
Водно- крахмальная система (10% мас.крахмала)	304,0	860,0	3,3	1,2
Молочно-крахмальная система (5% мас.крахмала)	121,5	654,0	8,2	1,5
Водно- крахмальная система (5% мас.крахмала)	600,6	1224,0	1,7	0,8

Согласно модели Уоспера и Циммермана [10] экспоненциальный хаpaктер протонной релаксации воды в сложных гетерогенных системах интерпрети­руется, как результат обмена между протонными фpaкциями с различными временами релаксации (Т_2,1). Единая измеряемая скорость релаксации (1/Т_2общ) определяется как сумма релаксационных вкладов каждой фpaкции:

1/Т_2общ = Σ1/Т₂                                 (1)

Для водно-крахмальных систем суммируются релаксационные вклады сво­бодной воды 1/Т_fw и воды, иммобилизованной полимером 1/Т_р (полимерный вклад). Для молочно-крахмальных систем вклад в наблюдаемое время релак­сации вносит также фpaкция молекул воды, иммобилизованных на казеино­вых мицеллах, лактозе, минеральных солях. Полимерный релаксационный вклад вычисляют по уравнению (2):

1/T_p = f n(T_2bw+τ),                     (2)

где f - мольная доля мономеров полимера (крахмала) относительно воды, n - число сайтов связывания молекул воды мономером биополимера, Т_2bw - время релаксации протонов связанной воды, τt - время «жизни» молекул воды в связанном состоянии.

С позиции принятой релаксационной модели скорость релаксации в иссле­дованных системах линейно связана с концентрацией крахмала (С), что под­тверждается экспериментальными зависимостями скоростей поперечной и продольной релаксаций от концентрации крахмала (рис.2).

Величины свободных члeнов в корреляционных уравнениях 1/Т₁ = 0,08С + 0,41 и 1/Т₂ = 0,27С + 0,45 близки к скорости релаксации чистой во­ды (при 20 ⁰С для чистой воды Т₂ = 2,02 с и Т₁ = 2, 51 с). Угловой коэффици­ент аппроксимирующих прямых хаpaктеризует релаксационную эффек­тивность крахмала, его иммобилизующую способность по отношению к воде, поскольку зависит от количества молекул воды, приходящихся на 1 моль по­лимера.

Концентрационные зависимости для молочно-крахмальных систем сохра­няют линейный хаpaктер (рис.2) и свидетельствуют об увеличении коэффи­циента релаксационной эффективности в 2 раза (1/Т₁ = 0,16С + 0,83; 1/Т₂ = 0,70С + 5,12), что подтверждает увеличение числа структурных контактов. Возрастание свободного члeна в корреляционных уравнениях до значения, хаpaктерного для цельного молока (1/T_2m = 5,2 с^-1), - ожидаемый результат, поскольку в систему добавляется новый источник релаксации - фpaкция мо­лекул воды, связанных с казеином и лактозой.

Рис.2. Зависимость скорости продольной (1,2) и поперечной (3,4) релаксаций от концентрации крахмала для водно-крахмальных (1,3) и молочно-крахмальных (2,4) систем.

Время релаксации связанной воды определяется подвижностью полимера в месте связывания, а также различной чувствительностью продольной и попе­речной релаксаций к медленным движениям, хаpaктерным для биополимер­ных систем при образовании надмолекулярных структур (гелей). Время про­дольной релаксации пpaктически нечувствительно к медленным движениям, поэтому для констатации структурных изменений в исследованных гетеро­генных системах изучали температурную зависимость поперечной релакса­ции (рис. 3). Эта взаимосвязь иллюстрирует различную направленность тем­пературного влияния на параметры Т_2bw и t в уравнении (2): с увеличением температуры Т_2bw уменьшается, t возрастает. Очевидно, что при 10 - 40^оС влияние температуры для водно-крахмальных гелей определяется измене­ниями t, т. е. в водно-крахмальных системах при рН 6,8 - значении, соот­ветствующем рН обезжиренного молока, образуются гелеподобные структу­ры. Увеличение вклада крахмала в релаксационную активность воды в мо­лочной дисперсионной среде, вероятно, связано с сокращением параметра Т_2bw, что подтверждается изменением углового коэффициента температурной зависимости поперечной релаксации (рис.3). Снижение Т_2bw свидетельствует о появлении более медленных движений белок-крахмальных ассоциатов.

Рис.3. Температурная зависимость поперечной релаксации Т₂
для молочно-крахмальной (1) и водно-крахмальной (2) систем;
содержание крахмала 15 мас.%.

Механизм гелеобразования заключается в образовании узлов студневой сет­ки в результате конформационного упорядочивания молекул. Образованию сетки способствует ассоциация биополимеров, которая проявляется в ком­плексной коацервации с последующим гелеобразованием. Гели, образован­ные в результате агрегации комплексов белок-полисахарид, называются ком­плексными. Изменение релаксационнй эффективности крахмала и увеличе­ние t свидетельствуют о синергизме гелеобразования. Отрицательно заря­женные мицеллы казеина включаются в сетку, сформированную крахмалом, взаимодействуя с положительно заряженными участками спирали макромо­лекулы крахмала. При этом возможно конформационное изменение строения мицеллы казеина, ее распад на субмицеллы, которые, в свою очередь, взаи­модействуют с сеткой крахмального геля, увеличивая количество контактов. Об отсутствии более глубоких конформационных изменений казеина, свиде­тельствует соответствие свободного члeна аппроксимирующих уравнений (рис.2) значению этой хаpaктеристики для обезжиренного молока.

Обобщая исследования Н⁺-релаксационных явлений в молочно-крахмальных системах, приходим к следующим выводам. Крахмал иммоби­лизует воду в молочной среде более активно, чем в водной. Казеин оказывает синергетическое влияние на гелеобразующую способность крахмала. Обра­зующийся комплексный гель представляет собой сетку из спиральных моле­кул крахмала, в ячейки которой включены мицеллы и субмицеллы казеина, взаимодействующие с положительно заряженными участками спирали и спо­собствующие образованию дополнительных узлов сетки.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Рабек Я. Экспериментальные методы в химии полимеров: ч.I М.: Мир, 1983. С.188-195.
2. Захарова Н.П., Соколова Н.Ю., Родин В.В., Измайлова В.Н., Ямпольская Г.П. Изучение состояния воды в сычужных и плавленых сырах ме­тодом ЯМР// Мол. пром-сть. 1997. №2. С.35.
3. Родин В.В., Измайлова В.Н. Липид-нуклеиновые взаимодействия в дисперсиях фосфолипидных везикул по данным методов ЯМР // Колл. журн. 1995. Т.57. № 2. С.231.
4. Rodin V.V., Izmailova V.N. R-approaches on transmitters and conformational transitions in protein-water-hydrocarbon sistem // Proc. work shop on magnetic resonance imaging and spectroscopy of muscle, Liverpool, U.K.1994. Р.1347.
5. Усманов Т.И. ЯМР-спектроскопия производных полисахаридов в связи с их молекулярной структурой// Высокомол. соед. 1991. Т. А33.№4. С.691.
6. Бови Ф. ЯМР высокого разрешения макромолекул.- М.: Химия. 1977. 456 с.
7. Бирштейн Т.М. Синтез, структура и свойства полимеров. Л.:Наука. 1989. 276 с.
8. Гросберг А.Ю., Шахнович Е.И. К теории гетерополимеров с заморо­женной беспорядочной первичной структурой: свойства глобулярного состояния, переходы типа клубок-глобула, возможные биофизические приложения // Биофизика. 1986. Т. 31. № 6. С. 1045.
9. Перри С., Амос Р., Брюер П. Пpaктическое руководство по жидкост­ной хроматографии. М.:Мир. 1974. 260 с.
10. Hiroyuki Kanai, Takeshi Amari. Negative thixotropy in ferric-oxide suspensions// Rheologika Acta. 1995. V.3. № 3. Р. 303.

---