ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОЙ МИКРОФЛЮОРИМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ > Полезные советы
Тысяча полезных мелочей    

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОЙ МИКРОФЛЮОРИМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОЙ МИКРОФЛЮОРИМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Голосеев Ю.А. Демченко Е.Ю. Щербакова К.В. Абакумова М.А. Статья в формате PDF 111 KB По богатству и разно­образию возможностей флюоресцентный анализ не имеет себе равных и становится наиболее распространен­ным как в исследовательской работе, так и в пpaктической деятельности. С помощью флюоресцентного анализа можно определять аминокислоты, белки, витамины, стероиды, неорганические, лекарственные и токсические вещества, ферменты. В основу метода флюоресцентного определения ферментативной активности положено измерение интенсивности свечения люминесцирующих продуктов распада флюорогенных субстратов под действием фермента. К настоящему времени из вестно свыше 50 ферментов обладающих соответствующими флюорогенными субстратами. Среди них такие ферменты как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пероксидаза широко применяемые в иммуноферментном анализе для получения иммуноконъюгатов. Целью настоящего исследования явилась разработка метода количественной микрофлюориметрии для определения активности ферментов. В работе в качестве примера использовали щелочную фосфатазу ("Serva", Германия). Концентрация фермента составляла 1мкг/мл. Флюорогенными субстратами служили: 3- метилфлюоресцеинфосфат (МФФ) и 4 - метилумбеллиферилфосфат (МУФ). Флюорогенными субстратами пропитывали фильтры GF/A Whatman (Англия) и вырезали из них штампом диски диаметром 9 мм. Изготовленные из боросиликатной стекломикрофибры фильтры обладают высокой химической стойкостью при низкой собственной флюоресценции. Исследуемый ферментсодержащий препарат в карбонатном буфере рН 9,8 объемом 20 мкл наносили на диски, помещали в чашку Петри и инкубировали 15 мин при 37°С. Активность щелочной фосфатазы оценивали по интенсивности люминесценции образующихся про­дуктов гидролиза субстратов: метилфлюоресцеина и 4-метилумбеллиферона. Интенсивность флюоресценции измеряли с помощью люминесцентного микроскопа "Люмам И3" с фотометрической насадкой ФМЭЛ-I. При необходимости можно воспользоваться световым микроскопом с люминесцентной насадкой ЛН-120. Длина вол­ны возбуждения составляла 490 и 365 нм, регистрации - 510 и 430нм для метилфлюоресцеина и 4-метилумбеллиферона соответственно. При исполь­зовании в качестве субстрата метилфлюоресцеина применя­ли светофильтры возбуждения ФС1-4, Б3-28, и С3С-24, запирающие свето­фильтры микроскопа - ЖС18 + ЖС19, для 4-метилумбеллиферона - УФС1-4, Б3-28 и С3С-24, увеличение объектива микроскопа х10, увеличение окуляра х10. В качестве источника излучения использовали ртутно-кварцевую лампу высокого давления ДРШ 250-3. Прием­ником флюоресценции служил фотоумножитель ФЭУ-79. Измерение проводили зондом диаметром 0,5 мм, который в комплек­те с примененным объективом микроскопа обеспечивал фотометрирование участка объекта диаметром 50 мкм. Сигнал с фотонасадки измеряли цифровым вольтметром Щ1310. Контролем служили диски без фермента. Минимально определяемая концентра­ция фосфатазы, при которой специфическое свечение дисков с ферментом досто­верно превышало уровень контроля вдвое хаpaктеризовала чувствительность метода. Сравнительный анализ определения ще­лочной фосфатазы с различными субстратами показал, что использование флюорогенного субстрата МУФ позволяло выявлять 4нг/мл, а флюорогенного субстрата МФФ- 15 нг/мл фермента. Время необходимое для определения фермента составляло 25-30 минут. Аналогичным образом можно определять активность β-галактозидазы и пероксидазы, используя в качестве флюорогенных субстратов 4-метилумбеллиферил-β-D-галактопиранозид и гомованилиновую кислоту. Таким образом, предложенный метод количественной микрофлюориметрии отличается простотой, высокой чувствительностью, требует минимальных объемов реагентов, что позволяет рекомендовать его для использования в лабораторной пpaктике для определения активности ферментов.


РОМАШОВ РОБЕРТ ВАСИЛЬЕВИЧ

РОМАШОВ РОБЕРТ ВАСИЛЬЕВИЧ Статья в формате PDF 174 KB...

05 04 2026 3:27:30

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ЗНАНИЙ СТУДЕНТОВ

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ЗНАНИЙ СТУДЕНТОВ Статья в формате PDF 103 KB...

04 04 2026 7:46:40

ВЛИЯНИЕ СОЧЕТАНИЙ ВИТАМИНОВ И ФИТОГОРМОНОВ НА УЛУЧШЕНИЕ РОСТА И МЕТАБОЛИЗМА ТОМАТА ПРИ ЗАСОЛЕНИИ

ВЛИЯНИЕ СОЧЕТАНИЙ ВИТАМИНОВ И ФИТОГОРМОНОВ НА УЛУЧШЕНИЕ РОСТА И МЕТАБОЛИЗМА ТОМАТА ПРИ ЗАСОЛЕНИИ Замачивание семян и опрыскивание вегетирующих растений томата растворами сочетаний витаминов: пантотеновая кислота–тиамин и фитогормонов: цитокинин–гибберелловая кислота, и совместным их сочетанием снижает токсическое действие хлоридного засоления, повышая всхожесть семян, рост проростков, стeбля, размеры листьев, интенсивность фотосинтеза и накопление общего белка. Наиболее эффективно во всех случаях комплексное сочетание витаминов с фитогормонами. ...

23 03 2026 14:54:43

РОССИЯ И ВТО: ПЛЮСЫ И МИНУСЫ

РОССИЯ И ВТО: ПЛЮСЫ И МИНУСЫ Статья в формате PDF 101 KB...

22 03 2026 12:20:27

Об интеграционном подходе в менеджменте

Об интеграционном подходе в менеджменте Статья в формате PDF 133 KB...

20 03 2026 12:51:41

ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОРТОВ И ЭЛИТ ЯБЛОНИ В АГРОЛАНДШАФТАХ В РАЗНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ЗОНАХ СЕВЕРНОГО КАВКАЗА

ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОРТОВ И ЭЛИТ ЯБЛОНИ В АГРОЛАНДШАФТАХ В РАЗНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ЗОНАХ СЕВЕРНОГО КАВКАЗА При оценке экономической эффективности культивирования сортов яблони в разных экологических условиях Северного Кавказа важными показателями являются продуктивность и качество продукции. Значительный интерес в этом отношении представляют сорта селекции Северо-Кавказского НИИ горного и предгорного садоводства: Фестиваль гор, Долинское, Златогор, Лескенское и другие, которые являются аборигенными и конкурентоспособными с культивируемыми в регионе интродуцированными зарубежными и отечественными сортами яблони. ...

17 03 2026 15:52:33

МЕДИЦИНСКАЯ ГЕОГРАФИЯ БИОГЕЛЬМИНТОЗОВОПИСТОРХОЗА

МЕДИЦИНСКАЯ ГЕОГРАФИЯ БИОГЕЛЬМИНТОЗОВОПИСТОРХОЗА Статья в формате PDF 227 KB...

07 03 2026 15:17:33

Еще:
Поддержать себя -1 :: Поддержать себя -2 :: Поддержать себя -3 :: Поддержать себя -4 :: Поддержать себя -5 :: Поддержать себя -6 :: Поддержать себя -7 :: Поддержать себя -8 :: Поддержать себя -9 :: Поддержать себя -10 :: Поддержать себя -11 :: Поддержать себя -12 :: Поддержать себя -13 :: Поддержать себя -14 :: Поддержать себя -15 :: Поддержать себя -16 :: Поддержать себя -17 :: Поддержать себя -18 :: Поддержать себя -19 :: Поддержать себя -20 :: Поддержать себя -21 :: Поддержать себя -22 :: Поддержать себя -23 :: Поддержать себя -24 :: Поддержать себя -25 :: Поддержать себя -26 :: Поддержать себя -27 :: Поддержать себя -28 :: Поддержать себя -29 :: Поддержать себя -30 :: Поддержать себя -31 :: Поддержать себя -32 :: Поддержать себя -33 :: Поддержать себя -34 :: Поддержать себя -35 :: Поддержать себя -36 :: Поддержать себя -37 :: Поддержать себя -38 ::