ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОЙ МИКРОФЛЮОРИМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Авторы
Файлы

Голосеев Ю.А. Демченко Е.Ю. Щербакова К.В. Абакумова М.А. Статья в формате PDF 111 KB По богатству и разнообразию возможностей флюоресцентный анализ не имеет себе равных и становится наиболее распространенным как в исследовательской работе, так и в пpaктической деятельности. С помощью флюоресцентного анализа можно определять аминокислоты, белки, витамины, стероиды, неорганические, лекарственные и токсические вещества, ферменты. В основу метода флюоресцентного определения ферментативной активности положено измерение интенсивности свечения люминесцирующих продуктов распада флюорогенных субстратов под действием фермента. К настоящему времени из вестно свыше 50 ферментов обладающих соответствующими флюорогенными субстратами. Среди них такие ферменты как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пероксидаза широко применяемые в иммуноферментном анализе для получения иммуноконъюгатов. Целью настоящего исследования явилась разработка метода количественной микрофлюориметрии для определения активности ферментов. В работе в качестве примера использовали щелочную фосфатазу ("Serva", Германия). Концентрация фермента составляла 1мкг/мл. Флюорогенными субстратами служили: 3- метилфлюоресцеинфосфат (МФФ) и 4 - метилумбеллиферилфосфат (МУФ). Флюорогенными субстратами пропитывали фильтры GF/A Whatman (Англия) и вырезали из них штампом диски диаметром 9 мм. Изготовленные из боросиликатной стекломикрофибры фильтры обладают высокой химической стойкостью при низкой собственной флюоресценции. Исследуемый ферментсодержащий препарат в карбонатном буфере рН 9,8 объемом 20 мкл наносили на диски, помещали в чашку Петри и инкубировали 15 мин при 37°С. Активность щелочной фосфатазы оценивали по интенсивности люминесценции образующихся продуктов гидролиза субстратов: метилфлюоресцеина и 4-метилумбеллиферона. Интенсивность флюоресценции измеряли с помощью люминесцентного микроскопа "Люмам И3" с фотометрической насадкой ФМЭЛ-I. При необходимости можно воспользоваться световым микроскопом с люминесцентной насадкой ЛН-120. Длина волны возбуждения составляла 490 и 365 нм, регистрации - 510 и 430нм для метилфлюоресцеина и 4-метилумбеллиферона соответственно. При использовании в качестве субстрата метилфлюоресцеина применяли светофильтры возбуждения ФС1-4, Б3-28, и С3С-24, запирающие светофильтры микроскопа - ЖС18 + ЖС19, для 4-метилумбеллиферона - УФС1-4, Б3-28 и С3С-24, увеличение объектива микроскопа х10, увеличение окуляра х10. В качестве источника излучения использовали ртутно-кварцевую лампу высокого давления ДРШ 250-3. Приемником флюоресценции служил фотоумножитель ФЭУ-79. Измерение проводили зондом диаметром 0,5 мм, который в комплекте с примененным объективом микроскопа обеспечивал фотометрирование участка объекта диаметром 50 мкм. Сигнал с фотонасадки измеряли цифровым вольтметром Щ1310. Контролем служили диски без фермента. Минимально определяемая концентрация фосфатазы, при которой специфическое свечение дисков с ферментом достоверно превышало уровень контроля вдвое хаpaктеризовала чувствительность метода. Сравнительный анализ определения щелочной фосфатазы с различными субстратами показал, что использование флюорогенного субстрата МУФ позволяло выявлять 4нг/мл, а флюорогенного субстрата МФФ- 15 нг/мл фермента. Время необходимое для определения фермента составляло 25-30 минут. Аналогичным образом можно определять активность β-галактозидазы и пероксидазы, используя в качестве флюорогенных субстратов 4-метилумбеллиферил-β-D-галактопиранозид и гомованилиновую кислоту. Таким образом, предложенный метод количественной микрофлюориметрии отличается простотой, высокой чувствительностью, требует минимальных объемов реагентов, что позволяет рекомендовать его для использования в лабораторной пpaктике для определения активности ферментов.

ОБЩИЙ КЛИНИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРОВИ КАК МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОСТСТРЕССОРНОЙ РЕАБИЛИТАЦИИ

В предложенной работе экспериментально доказано, что при хроническом стрессе, при нарушенном равновесии симпатического и парасимпатического отделов нервной системы, количество клеток периферической крови, изменяясь, не выходит за пределы нормы. Вегетативный баланс хаpaктеризуется средним арифметическим границ нормальных показателей. Общий клинический анализ крови является показателем функционального состояния и может быть предложен как метод, определяющий эффективность проводимого лечения в постстрессорной реабилитации. ...

31 10 2026 7:12:13

ПОДЖЕЛУДОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА У БЕЛОЙ КРЫСЫ

Статья в формате PDF 297 KB...

30 10 2026 17:50:37

РАЗВИТИЕ ЛЕСНОГО КОМПЛЕКСА В РОССИИ

Статья в формате PDF 314 KB...

29 10 2026 21:51:24

ЗАКОНОМЕРНОСТИ МОРФОГЕНЕЗА СОЕДИНИТЕЛЬНОТКАННОГО ОСТОВА ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ УЗЛОВ СПИННОМОЗГОВЫХ НЕРВОВ ЧЕЛОВЕКА

Статья в формате PDF 111 KB...

28 10 2026 19:55:51

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПОДХОДА К РЕШЕНИЮ ПРОБЛЕМЫ УТИЛИЗАЦИИ МЫШЬЯК СОДЕРЖАЩИХ ОТХОДОВ

Статья в формате PDF 112 KB...

27 10 2026 7:30:50

Влияние нефтезагрязнения на состояние природного фона почв

Для оценки современного состояния природного фона и его изменений под действием техногенных факторов выполнены геохимические исследования почв на различных объектах нефтегазового комплекса Якутии. Показано, что при попадании в почву нефть и нефтепродукты сорбируются почвогрунтами и смешиваются с нативным органическим веществом почв, что приводит к изменению природного фона вплоть до формирования аномальных поверхностных геохимических полей техногенного генезиса. ...

26 10 2026 22:46:49

К ВОПРОСУ ОБОСНОВАНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОПИОИДНЫХ НЕЙРОПЕПТИДОВ В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ ДИФФУЗНЫМ НЕЙРОДЕРМИТОМ

Статья в формате PDF 119 KB...

25 10 2026 10:10:50

НОРМАЛИЗАЦИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ СТЕНКИ СОСУДОВ НА ФИБРИНОЛИЗ И АНТИКОАГУЛЯЦИЮ У БОЛЬНЫХ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ С МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ С ПОМОЩЬЮ ЛИЗИНОПРИЛА

Статья в формате PDF 99 KB...

24 10 2026 1:12:19

ОЦЕНКА КОНФОРМАЦИОННОЙ СТАБИЛЬНОСТИ КОМПЛЕКСА: 2-МЕТИЛ-1,3,2-ДИОКСАБОРИНАН – МОЛЕКУЛА ВОДЫ

Статья в формате PDF 126 KB...

23 10 2026 12:38:28

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕНСКИХ СВОЙСТВ НОВОЙ СМАЗОЧНО-ОХЛАЖДАЮЩЕЙ ЖИДКОСТИ

Статья в формате PDF 100 KB...

22 10 2026 8:46:40

КАЧЕСТВО ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ

Статья в формате PDF 130 KB...

21 10 2026 17:51:21

Новые приборы в реологии пищевых систем

Статья в формате PDF 114 KB...

20 10 2026 16:57:38

Изменение уровня молекул средней массы при внутриутробном инфицировании плода

Статья в формате PDF 106 KB...

19 10 2026 8:34:50

ФОРМИРОВАНИЕ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА ЧЕЛОВЕКА В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ

Статья посвящена актуальной морфологической проблеме – формирование слизистой оболочки желудка человека, в раннем эмбриогенезе. Проведен анализ и обобщение научных данных в отечественной и зарубежной литературе о формировании слизистой оболочки желудка. Рассматривается вопрос о процессе формирования врожденных пороков развития желудка. ...

18 10 2026 15:53:18

СОТРУДНИЧЕСТВО ШКОЛЫ И ВУЗА – НОВАЯ ГРАНЬ ПРОФИЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Статья в формате PDF 101 KB...

17 10 2026 5:47:33

Филогенетическое формирование многокорневых зубов млекопитающих и человека

Статья в формате PDF 111 KB...

16 10 2026 22:57:23

ОБ ИЗВЛЕЧЕНИИ КУМАРИНОВ ИЗ БОРЩЕВИКА

Статья в формате PDF 121 KB...

15 10 2026 12:18:40

БОЧКАРЁВ НИКОЛАЙ ИВАНОВИЧ

Статья в формате PDF 189 KB...

14 10 2026 14:33:26

ОРГАНИЗАЦИЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА НА ОСНОВЕ ПРОЕКТНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ И ИНДИВИДУАЛИЗИРОВАННЫХ ФОРМ УЧЕБНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ (учебно-методическое пособие)

Статья в формате PDF 102 KB...

13 10 2026 2:14:57

ОПОГРАФИЯ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ В БАССЕЙНЕ ЧРЕВНОЙ АРТЕРИИ У МОРСКОЙ СВИНКИ

Лимфатические узлы морской свинки размещаются вдоль чревной артерии, а также ее ветвей и ряда вен: печеночные – около воротной вены печени, панкреатические и селезеночные – около селезеночной вены. ...

12 10 2026 8:24:17

Показатели стадий эндогенной интоксикации при пищевых токсикоинфекциях

Статья в формате PDF 114 KB...

11 10 2026 23:24:27

МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА ГЕТЕРОГЕННОЙ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ ПЕРЕОХЛАЖДЕННЫХ КАПЕЛЬ В ОБЛАКАХ

Статья в формате PDF 126 KB...

10 10 2026 4:13:31

ВЛИЯНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА НА ГИБЕЛЬ КЛЕТОК МЕРИСТЕМЫ ALLIUM FISTULOSUM

Статья в формате PDF 123 KB...

09 10 2026 13:31:47

ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ И ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ В ВИРУСОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ

Статья в формате PDF 114 KB...

08 10 2026 22:43:40

ВЛИЯНИЕ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА РАССПРОСТРАНЕННОСТЬ ВРОЖДЕННЫХ АНОМАЛИЙ РАЗВИТИЯ

Статья в формате PDF 98 KB...

07 10 2026 0:36:43

ГИСТОХИМИЯ NADPH-ДИАФОРАЗЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ САМЦОВ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФАКТОРОВ

В центральных и периферических отделах нервной системы, осуществляющих регуляцию копулятивной функции самцов крыс, широко представлены нервные клетки, обладающие активностью NADPH-диафоразы. В переднем гипоталамусе они представлены нейронами двух типов (с высокой и низкой активностью), в боковых рогах тоpaколюмбального отдела спинного мозга – нейронами с высокой активностью фермента. Высокая активность NADPHдиафоразы выявлена также в вегетативных микроганглиях и нервных волокнах наружных и внутренних пoлoвых органов, а также – гладкомышечных элементах кавернозных тел. Активностью фермента в различной степени помимо вышеуказанных отделов обладают интерстициальные клетки семенников, эпителий концевых отделов и протоков простаты, семенных пузырьков, мочевыводящих путей. Под воздействием нeблагоприятных (острый и хронический стресс, острая и хроническая алкогольная и наркотическая интоксикация) отмечено увеличение числа NADPH-реактивных структур и активности фермента в них. ...