ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОЙ МИКРОФЛЮОРИМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Авторы
Файлы

Голосеев Ю.А. Демченко Е.Ю. Щербакова К.В. Абакумова М.А. Статья в формате PDF 111 KB По богатству и разнообразию возможностей флюоресцентный анализ не имеет себе равных и становится наиболее распространенным как в исследовательской работе, так и в пpaктической деятельности. С помощью флюоресцентного анализа можно определять аминокислоты, белки, витамины, стероиды, неорганические, лекарственные и токсические вещества, ферменты. В основу метода флюоресцентного определения ферментативной активности положено измерение интенсивности свечения люминесцирующих продуктов распада флюорогенных субстратов под действием фермента. К настоящему времени из вестно свыше 50 ферментов обладающих соответствующими флюорогенными субстратами. Среди них такие ферменты как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пероксидаза широко применяемые в иммуноферментном анализе для получения иммуноконъюгатов. Целью настоящего исследования явилась разработка метода количественной микрофлюориметрии для определения активности ферментов. В работе в качестве примера использовали щелочную фосфатазу ("Serva", Германия). Концентрация фермента составляла 1мкг/мл. Флюорогенными субстратами служили: 3- метилфлюоресцеинфосфат (МФФ) и 4 - метилумбеллиферилфосфат (МУФ). Флюорогенными субстратами пропитывали фильтры GF/A Whatman (Англия) и вырезали из них штампом диски диаметром 9 мм. Изготовленные из боросиликатной стекломикрофибры фильтры обладают высокой химической стойкостью при низкой собственной флюоресценции. Исследуемый ферментсодержащий препарат в карбонатном буфере рН 9,8 объемом 20 мкл наносили на диски, помещали в чашку Петри и инкубировали 15 мин при 37°С. Активность щелочной фосфатазы оценивали по интенсивности люминесценции образующихся продуктов гидролиза субстратов: метилфлюоресцеина и 4-метилумбеллиферона. Интенсивность флюоресценции измеряли с помощью люминесцентного микроскопа "Люмам И3" с фотометрической насадкой ФМЭЛ-I. При необходимости можно воспользоваться световым микроскопом с люминесцентной насадкой ЛН-120. Длина волны возбуждения составляла 490 и 365 нм, регистрации - 510 и 430нм для метилфлюоресцеина и 4-метилумбеллиферона соответственно. При использовании в качестве субстрата метилфлюоресцеина применяли светофильтры возбуждения ФС1-4, Б3-28, и С3С-24, запирающие светофильтры микроскопа - ЖС18 + ЖС19, для 4-метилумбеллиферона - УФС1-4, Б3-28 и С3С-24, увеличение объектива микроскопа х10, увеличение окуляра х10. В качестве источника излучения использовали ртутно-кварцевую лампу высокого давления ДРШ 250-3. Приемником флюоресценции служил фотоумножитель ФЭУ-79. Измерение проводили зондом диаметром 0,5 мм, который в комплекте с примененным объективом микроскопа обеспечивал фотометрирование участка объекта диаметром 50 мкм. Сигнал с фотонасадки измеряли цифровым вольтметром Щ1310. Контролем служили диски без фермента. Минимально определяемая концентрация фосфатазы, при которой специфическое свечение дисков с ферментом достоверно превышало уровень контроля вдвое хаpaктеризовала чувствительность метода. Сравнительный анализ определения щелочной фосфатазы с различными субстратами показал, что использование флюорогенного субстрата МУФ позволяло выявлять 4нг/мл, а флюорогенного субстрата МФФ- 15 нг/мл фермента. Время необходимое для определения фермента составляло 25-30 минут. Аналогичным образом можно определять активность β-галактозидазы и пероксидазы, используя в качестве флюорогенных субстратов 4-метилумбеллиферил-β-D-галактопиранозид и гомованилиновую кислоту. Таким образом, предложенный метод количественной микрофлюориметрии отличается простотой, высокой чувствительностью, требует минимальных объемов реагентов, что позволяет рекомендовать его для использования в лабораторной пpaктике для определения активности ферментов.

АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНОГО ДНК – ЛОКУСА 256A/G ГЕНА ПЕРЕНОСЧИКА ДОФАМИНА SLC6A3 И УРОВНЕЙ ДОФАМИНА С ПОВЫШЕННОЙ ТРЕВОЖНОСТЬЮ

В работе впервые приведены сведения об ассоциации полиморфного ДНК – локуса 256A/G гена переносчика дофамина SLC6A3 и уровней дофамина с повышенной тревожностью крыс с генотипом А2/А2 по локусу TAG 1A DRD2. ...

02 05 2026 11:19:48

ХАРАКТЕРИСТИКА АССОЦИАЦИЙ РЕЗИДЕНТНЫХ СИМБИОНТОВ КОЖИ ПРИ ПЕРВИЧНОЙ РОЖЕ ГОЛЕНЕЙ ДО И ПОСЛЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ

Статья в формате PDF 111 KB...

01 05 2026 11:22:43

АКТУАЛЬНОСТЬ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Статья в формате PDF 129 KB...

30 04 2026 8:38:33

Морфологические свойства ишемизированной почки на фоне альфа-интерферона

Статья в формате PDF 110 KB...

29 04 2026 14:33:41

О возможной корреляции между уровнем oнкoлoгических заболеваний и наличием природных источников радиации

Статья в формате PDF 127 KB...

28 04 2026 10:33:16

КЛИНИКО-АНАТОМИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЛЕЧЕБНОЙ ТАКТИКИ ПРИ ВЫВИХАХ АКРОМИАЛЬНОГО КОНЦА КЛЮЧИЦЫ

Изучена анатомическая изменчивость строения акромиально-ключичного сустава и прочность его связок. Разработан собственный способ лечения больных с вывихом акромиального конца ключицы. Приведены показания для консервативного и хирургического лечения вывихов ключицы. ...

27 04 2026 13:38:16

ОСОБЕННОСТИ УПЛОТНЯЕМОСТИ ДВУХФАЗНЫХ ПОРОШКОВЫХ КОМПОЗИЦИЙ

В настоящей работе исследована зависимость плотности прессовок на железной, медной и никелевой с различными углерод содержащими порошковыми наполнителями от давления статического прессования. Для всех изучаемых двухфазных порошковых смесей, и для каждой стадии прессования рассчитаны постоянные уплотняемости. Физический смысл постоянных в предложенной работе выяснен. Для каждой стадии прессования определен интервал плотности в зависимости от химического и концентрационного составов порошковой смеси. В работе, приведены данные уплотняемости порошкового тела при приложении давлении прессования в условиях статической нагрузки, используя которые можно объяснить процессы, наблюдаемые в процессе уплотнения порошка. Оценка уплотняемости порошков позволяет составить более эффективную технологию изготовления порошковых изделий с заданными значениями плотности. ...

26 04 2026 7:15:57

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ В ЛЕЧЕНИИ ДЕТЕЙ С ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНЬЮ

Включение имунофана и полиоксидония в комплексное лечение детей с язвенной болезнью двенадцатипёрстной кишки обеспечивало более быструю положительную динамику клинико-лабораторных показателей и более быстрое наступление клинической ремиссии, нормализацию большинства параметров иммунологической реактивности. ...

25 04 2026 17:58:12

ИММУНИТЕТ И РАЗЛИЧНЫЕ СТАДИИ СТРЕССОРНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

Изучение иммунитета при стрессе является правомерным в оценке адаптивных систем организма и его резервных возможностей. На основании анализа функциональных возможностей иммунитета можно воздействовать на адаптивные системы и прогнозировать течение стресс-реакции. ...