ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОЙ МИКРОФЛЮОРИМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Авторы
Файлы

Голосеев Ю.А. Демченко Е.Ю. Щербакова К.В. Абакумова М.А. Статья в формате PDF 111 KB По богатству и разнообразию возможностей флюоресцентный анализ не имеет себе равных и становится наиболее распространенным как в исследовательской работе, так и в пpaктической деятельности. С помощью флюоресцентного анализа можно определять аминокислоты, белки, витамины, стероиды, неорганические, лекарственные и токсические вещества, ферменты. В основу метода флюоресцентного определения ферментативной активности положено измерение интенсивности свечения люминесцирующих продуктов распада флюорогенных субстратов под действием фермента. К настоящему времени из вестно свыше 50 ферментов обладающих соответствующими флюорогенными субстратами. Среди них такие ферменты как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пероксидаза широко применяемые в иммуноферментном анализе для получения иммуноконъюгатов. Целью настоящего исследования явилась разработка метода количественной микрофлюориметрии для определения активности ферментов. В работе в качестве примера использовали щелочную фосфатазу ("Serva", Германия). Концентрация фермента составляла 1мкг/мл. Флюорогенными субстратами служили: 3- метилфлюоресцеинфосфат (МФФ) и 4 - метилумбеллиферилфосфат (МУФ). Флюорогенными субстратами пропитывали фильтры GF/A Whatman (Англия) и вырезали из них штампом диски диаметром 9 мм. Изготовленные из боросиликатной стекломикрофибры фильтры обладают высокой химической стойкостью при низкой собственной флюоресценции. Исследуемый ферментсодержащий препарат в карбонатном буфере рН 9,8 объемом 20 мкл наносили на диски, помещали в чашку Петри и инкубировали 15 мин при 37°С. Активность щелочной фосфатазы оценивали по интенсивности люминесценции образующихся продуктов гидролиза субстратов: метилфлюоресцеина и 4-метилумбеллиферона. Интенсивность флюоресценции измеряли с помощью люминесцентного микроскопа "Люмам И3" с фотометрической насадкой ФМЭЛ-I. При необходимости можно воспользоваться световым микроскопом с люминесцентной насадкой ЛН-120. Длина волны возбуждения составляла 490 и 365 нм, регистрации - 510 и 430нм для метилфлюоресцеина и 4-метилумбеллиферона соответственно. При использовании в качестве субстрата метилфлюоресцеина применяли светофильтры возбуждения ФС1-4, Б3-28, и С3С-24, запирающие светофильтры микроскопа - ЖС18 + ЖС19, для 4-метилумбеллиферона - УФС1-4, Б3-28 и С3С-24, увеличение объектива микроскопа х10, увеличение окуляра х10. В качестве источника излучения использовали ртутно-кварцевую лампу высокого давления ДРШ 250-3. Приемником флюоресценции служил фотоумножитель ФЭУ-79. Измерение проводили зондом диаметром 0,5 мм, который в комплекте с примененным объективом микроскопа обеспечивал фотометрирование участка объекта диаметром 50 мкм. Сигнал с фотонасадки измеряли цифровым вольтметром Щ1310. Контролем служили диски без фермента. Минимально определяемая концентрация фосфатазы, при которой специфическое свечение дисков с ферментом достоверно превышало уровень контроля вдвое хаpaктеризовала чувствительность метода. Сравнительный анализ определения щелочной фосфатазы с различными субстратами показал, что использование флюорогенного субстрата МУФ позволяло выявлять 4нг/мл, а флюорогенного субстрата МФФ- 15 нг/мл фермента. Время необходимое для определения фермента составляло 25-30 минут. Аналогичным образом можно определять активность β-галактозидазы и пероксидазы, используя в качестве флюорогенных субстратов 4-метилумбеллиферил-β-D-галактопиранозид и гомованилиновую кислоту. Таким образом, предложенный метод количественной микрофлюориметрии отличается простотой, высокой чувствительностью, требует минимальных объемов реагентов, что позволяет рекомендовать его для использования в лабораторной пpaктике для определения активности ферментов.

Применение макролидов и фторхинолонов для коррекции нарушений иммунитета при экспериментальном панкреатите

Статья в формате PDF 103 KB...

11 08 2026 23:30:17

ИСТОКИ ВОЗНИКНОВЕНИЯ И ПРЕДПОСЫЛКИ РАЗВИТИЯ СИСТЕМЫ ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ В ТЮМЕНСКОЙ ОБЛАСТИ

Статья в формате PDF 122 KB...

10 08 2026 16:19:42

Арт-объект как специфичная художественная форма

Статья в формате PDF 314 KB...

09 08 2026 15:52:23

ТАНГАНОВ БОРИС БАДМАЕВИЧ

Статья в формате PDF 142 KB...

08 08 2026 15:41:56

ТИПОЛОГИЯ ЛИЧНОСТНЫХ СВОЙСТВ, ПРОЦЕССЫ КРАТКОВРЕМЕННОЙ ПАМЯТИ ВО ВЗАИМОСВЯЗИ С ПОКАЗАТЕЛЯМИ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Статья в формате PDF 116 KB...

07 08 2026 11:21:41

ПРИВЕТСТВИЯ В ПОВСЕДНЕВНОЙ РЕЧИ СТУДЕНТОВ

Статья в формате PDF 245 KB...

06 08 2026 21:34:34

Управление качеством образования в учебном заведении (монография)

Статья в формате PDF 312 KB...

05 08 2026 12:41:42

ОБЪЕКТЫ МЕДИЦИНСКОГО ПРАВА КАК КРИТЕРИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТРАСЛИ ЮРИДИЧЕСКОЙ НАУКИ

Статья в формате PDF 263 KB...

04 08 2026 15:40:54

НОВЫЕ ВИДЫ ОВСЯНОГО ПЕЧЕНЬЯ

Статья в формате PDF 522 KB...

03 08 2026 14:10:54

Объектно-ориентированные модели представления корпоративных знаний

Статья в формате PDF 106 KB...

02 08 2026 0:31:58

АНОМАЛИИ ПЛАНЕТ СОЛНЕЧНОЙ СИСТЕМЫ

С целью проверки космологических и геологических теорий всё больший интерес вызывают измерения аномалий: увеличение радиусов орбит планет, увеличение радиусов планет, замедление вращения планет. Технические возможности таких измерений имеются. Эмпирическая Теория Вселенной позволяет легко вычислять указанные аномалии. В статье показан метод расчёта аномалий и некоторые результаты для планет Солнечной системы. Сравнение расчёта с уже имеющимися измерениями (удаление Луны от Земли, удаление Земли от Солнца, замедление вращения Земли) показывает хорошее согласие расчёта и измерения. ...