ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОЙ МИКРОФЛЮОРИМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Авторы
Файлы

Голосеев Ю.А. Демченко Е.Ю. Щербакова К.В. Абакумова М.А. Статья в формате PDF 111 KB По богатству и разнообразию возможностей флюоресцентный анализ не имеет себе равных и становится наиболее распространенным как в исследовательской работе, так и в пpaктической деятельности. С помощью флюоресцентного анализа можно определять аминокислоты, белки, витамины, стероиды, неорганические, лекарственные и токсические вещества, ферменты. В основу метода флюоресцентного определения ферментативной активности положено измерение интенсивности свечения люминесцирующих продуктов распада флюорогенных субстратов под действием фермента. К настоящему времени из вестно свыше 50 ферментов обладающих соответствующими флюорогенными субстратами. Среди них такие ферменты как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пероксидаза широко применяемые в иммуноферментном анализе для получения иммуноконъюгатов. Целью настоящего исследования явилась разработка метода количественной микрофлюориметрии для определения активности ферментов. В работе в качестве примера использовали щелочную фосфатазу ("Serva", Германия). Концентрация фермента составляла 1мкг/мл. Флюорогенными субстратами служили: 3- метилфлюоресцеинфосфат (МФФ) и 4 - метилумбеллиферилфосфат (МУФ). Флюорогенными субстратами пропитывали фильтры GF/A Whatman (Англия) и вырезали из них штампом диски диаметром 9 мм. Изготовленные из боросиликатной стекломикрофибры фильтры обладают высокой химической стойкостью при низкой собственной флюоресценции. Исследуемый ферментсодержащий препарат в карбонатном буфере рН 9,8 объемом 20 мкл наносили на диски, помещали в чашку Петри и инкубировали 15 мин при 37°С. Активность щелочной фосфатазы оценивали по интенсивности люминесценции образующихся продуктов гидролиза субстратов: метилфлюоресцеина и 4-метилумбеллиферона. Интенсивность флюоресценции измеряли с помощью люминесцентного микроскопа "Люмам И3" с фотометрической насадкой ФМЭЛ-I. При необходимости можно воспользоваться световым микроскопом с люминесцентной насадкой ЛН-120. Длина волны возбуждения составляла 490 и 365 нм, регистрации - 510 и 430нм для метилфлюоресцеина и 4-метилумбеллиферона соответственно. При использовании в качестве субстрата метилфлюоресцеина применяли светофильтры возбуждения ФС1-4, Б3-28, и С3С-24, запирающие светофильтры микроскопа - ЖС18 + ЖС19, для 4-метилумбеллиферона - УФС1-4, Б3-28 и С3С-24, увеличение объектива микроскопа х10, увеличение окуляра х10. В качестве источника излучения использовали ртутно-кварцевую лампу высокого давления ДРШ 250-3. Приемником флюоресценции служил фотоумножитель ФЭУ-79. Измерение проводили зондом диаметром 0,5 мм, который в комплекте с примененным объективом микроскопа обеспечивал фотометрирование участка объекта диаметром 50 мкм. Сигнал с фотонасадки измеряли цифровым вольтметром Щ1310. Контролем служили диски без фермента. Минимально определяемая концентрация фосфатазы, при которой специфическое свечение дисков с ферментом достоверно превышало уровень контроля вдвое хаpaктеризовала чувствительность метода. Сравнительный анализ определения щелочной фосфатазы с различными субстратами показал, что использование флюорогенного субстрата МУФ позволяло выявлять 4нг/мл, а флюорогенного субстрата МФФ- 15 нг/мл фермента. Время необходимое для определения фермента составляло 25-30 минут. Аналогичным образом можно определять активность β-галактозидазы и пероксидазы, используя в качестве флюорогенных субстратов 4-метилумбеллиферил-β-D-галактопиранозид и гомованилиновую кислоту. Таким образом, предложенный метод количественной микрофлюориметрии отличается простотой, высокой чувствительностью, требует минимальных объемов реагентов, что позволяет рекомендовать его для использования в лабораторной пpaктике для определения активности ферментов.

БОБЫ ЧЕЧЕВИЦЫ – ПЕРСПЕТИВНЫЙ БЕЛКОВЫЙ ОБОГАТИТЕЛЬ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Статья в формате PDF 110 KB...

23 03 2026 17:15:35

ЧТО НАДО ЗНАТЬ ПРИ ПОСТУПЛЕНИИ В ВУЗ. ИННОВАЦИОННЫЕ ПОДХОДЫ

Статья в формате PDF 241 KB...

22 03 2026 21:29:11

ЗА «НОВУЮ ВЕРУ». ГОСУДАРСТВЕННАЯ ПОЛИТИКА В ОТНОШЕНИИ РЕЛИГИИ И ПОЛИТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ СРЕДИ МОЛОДЁЖИ РСФСР (1918 – 1929 ГГ.) (монография)

Статья в формате PDF 136 KB...

21 03 2026 2:34:24

РАЗРАБОТКА СИРОПА И ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НА БАЗЕ КОРНЕЙ И КОРНЕВИЩ РОДИОЛЫ РОЗОВОЙ

Статья в формате PDF 147 KB...

20 03 2026 1:19:57

ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСНОГО БЕЛКОВОГО ОБОГАТИТЕЛЯ НА АРОМАТ И ПЕРЕВАРИВАЕМОСТЬ СДОБНЫХ СУХАРНЫХ ИЗДЕЛИЙ

Статья в формате PDF 138 KB...

19 03 2026 23:46:45

СТРОЕНИЕ СТЕНКИ ЛИМФАНГИОНОВ НЕКОТОРЫХ ОРГАНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Статья в формате PDF 119 KB...

18 03 2026 16:14:18

ЦЕЛИ И СОДЕРЖАНИЕ ОБУЧЕНИЯ ГИБКИМ ТЕХНОЛОГИЯМ РАЗРАБОТКИ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ

Статья в формате PDF 137 KB...

17 03 2026 1:20:15

РЕКОНСТРУКТИВНЫЕ ВМЕШАТЕЛЬСТВА НА ЖЕЛЧЕВЫВОДЯЩИХ ПУТЯХ

Статья в формате PDF 113 KB...

16 03 2026 4:33:33

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВТОРИЧНЫХ ОТХОДОВ МУСОРОПЕРЕРАБАТЫВАЮЩИХ ЗАВОДОВ В ПРОИЗВОДСТВЕ СТРОИТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ

Статья в формате PDF 122 KB...

15 03 2026 21:38:14

СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОЧЕК И ПЕЧЕНИ ПРИ СТЕНОЗЕ ЛЕГОЧНОГО СТВОЛА В СТАДИЮ ДЕКОМПЕНСАЦИИ

Статья в формате PDF 118 KB...

14 03 2026 18:50:25

ПРОБЛЕМЫ ВОДОСНАБЖЕНИЯ И ВОДООТВЕДЕНИЯ В ИРКУТСКЕ И ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ

Статья в формате PDF 277 KB...

13 03 2026 18:33:58

Поливариантная модель первичной сукцессии растительности на экотопически гетерогенной территории (на примере карьеров лесотундры)

На примере самозарастания песчаных карьеров разработана модель, описывающая формирование растительности в ходе первичной сукцессии на территории со сложным рельефом поверхности и соседством контрастных экотопов. ...

12 03 2026 3:25:20

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ И МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОРАЖЕНИЯ ГЕПАТОЦИТОВ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА В

Статья в формате PDF 245 KB...

11 03 2026 10:20:43

МОРФОТИП, ВЕГЕТАТИВНЫЙ ГОМЕОСТАЗ, ДЕРМАТОТИП И МИКРОНУТРИЕНТЫ ПОДРОСТКОВ И ЮНОШЕЙ

Статья в формате PDF 123 KB...

10 03 2026 22:24:37

Я И МОЁ ЗДОРОВЬЕ

В статье излагается позиция автора о необходимости максимально ответственно относиться к своему здоровью, исходя из объективных предпосылок нашего времени. ...