ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ ИЗ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ЛВ-7

1

• Авторы
• Резюме
• Файлы

Артюхов В.Г. Ковалева Т.А. Кожокина О.М. Тоньшева Н.В. Разработана методика выделения и очистки глюкоамилазы, включающая стадии ультрафильтрации на мембране УФМ-50, осаждения изопропиловым спиртом и гель-хроматографии на сефадексах G-25 и G-150, которая позволила получить гомогенный препарат глюкоамилазы из Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7 с 70-кратной степенью чистоты; кажущаяся молекулярная масса фермента 99,8 кДа. Статья в формате PDF 127 KB Выделение и очистка ферментных препаратов от примесей является важным этапом в изучении их свойств. Ферменты, как правило, выделяют непосредственно из биомассы гриба или из культуральной жидкости, а также из экстpaктов поверхностной культуры.

Анализ данных литературы указывает на многообразие комбинаций используемых авторами методов получения амилолитических препаратов с высокой степенью чистоты [8, 11]. В этой связи мы изучили влияние на эффективность выделения и очистки глюкоамилазы из Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7 различных органических растворителей, а также условий хроматографирования.

Культивирование продуцента проводили в лабораторных условиях в два этапа. Сначала дрожжи выращивали твердофазным способом в чашках Петри в течение 48 ч при температуре 26-27 С и рН субстрата 4,7-5,0, используя в качестве питательной среды агар-агар и солодовое неохмеленное сусло (8% сухого вещества). На втором этапе полученный инокулят вносили в колбы в мелассную среду (меласса - 10% сухого вещества) и осуществляли культивирование глубинным методом в течение 24 ч при температуре 30-32 С и рН субстрата 4,7-5,0. Готовую биомассу продуцента сушили 3-4 дня при 25-27 С, измельчали до порошкообразного состояния. Для разрушения клеточной стенки и перевода глюкоамилазы в раствор дрожжи тщательно растирали с песком или измельченным стеклом.

Экстpaкцию фермента проводили ацетатным буфером с рН 4,7 при постоянном перемешивании в течение 1,5-2,0 ч при температуре 20-22 С из 5% раствора дрожжей. Для концентрирования экстpaкта культуры дрожжей S. cerevisiae проводили ультрафильтрацию на мембране УФМ-50. Каталитическую активность глюкоамилазы определяли глюкозооксидазным методом реагентами "Оксохром Глюкоза С" ("Lachema", Чехия),. содержание белка в препарате по методу Лоури [7]. Очистку фермента от низкомолекулярных примесей осуществляли методом гельхроматографии на сефадексе G-25, от высокомолекулярных на сефадексе G-150. Контроль гомогенности глюкоамилазы проводили путем электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Дэвиса [3]. Окрашивание белковых полос осуществляли, используя нитрат серебра [14].

Известно, что белковые молекулы в присутствии органических растворителей способны образовывать агрегаты и выпадать в осадок, так как сила электростатического притяжения обратно пропорциональна диэлектрической постоянной среды, которая в данном случае уменьшается [1,2]. В этой связи нами было изучено влияние различных концентраций (50,0-83,3%) ацетона, изопропилового и этилового спиртов на эффективность осаждения глюкоамилазы.

Анализ литературы показал, что при комнатной температуре большинство ферментов быстро денатурируется органическими растворителями [1, 7, 10]. Низкая температура не только пpeдoxpaняет фермент от инактивации, но и усиливает осаждающее действие растворителей. Поэтому культуральную жидкость охлаждали до 2 С, органические растворители - до -6 С. Внесение осадителя в экстpaкт фермента проводили при постоянном перемешивании, поместив колбу в емкость со льдом. Далее осуществляли центрифугирование при 3000 g в течение 15 минут, полученный осадок растворяли в минимальном объеме ацетатного буфера (рН 4,7) для снижения в препарате концентрации органического растворителя.

Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что использование органических растворителей в диапазоне концентраций 50,0-83,3% по-разному отражается на выходе глюкоамилазы и величине ее удельной активности.

Выявлено, что максимальный выход фермента 38,6% наблюдается после осаждения изопропиловым спиртом в концентрации 80,0%, что на 1,5% больше по сравнению с действием этилового спирта и на 5,7% превышает данную величину для ацетона.

При более низких значениях концентрации органических растворителей процент выхода глюкоамилазы понижается незначительно, однако, удельная активность составляет лишь  30% от максимальной величины. Высокие концентрации осадителей (83,3%) снижают каталитическую активность глюкоамилазы и уменьшают выход фермента на  5%. Следовательно, осаждение глюкоамилазы из культуральной жидкости дрожжей S. сerevisiae ЛВ-7 целесообразно осуществлять с помощью 80,0% изопропилового спирта, т.к. именно в этом случае выход фермента максимален (38,6%), а удельная активность достаточно высокая (0,43 ед/мг).

Результаты наших экспериментов хорошо согласуются с данными литературы. Показана высокая эффективность применения изопропилового спирта для выделения амилолитического комплекса из экстpaкта поверхностной культуры Aspergillus oryzae [4, 13].

Получение ферментных препаратов основано на осаждении белка путем дегидратации его мицелл и снятия заряда гидрофильной молекулы органическими растворителями или нейтральными солями. При этом важную роль играет начальная величина концентрации ионов водорода ферментной вытяжки. Известно, что из одного и того же раствора при различных значениях рН можно получить неодинаковый выход осадков, содержащих разное количество фермента [1, 7]. Это связано с наиболее полным осаждением фермента при величине рН, соответствующей изоэлектрической точке данного белка. Так как для глюкоамилазы из дрожжей S. cerevisiae ЛВ-7 подобные данные отсутствуют, мы проводили осаждение изопропанолом в концентрации 80,0% из экстpaктов, приготовленных на ацетатном буфере с диапазоном значений рН 3,5-6,0.

Обнаружено, что наибольший выход глюкоамилазы (37,3%) наблюдается в интервале величин рН 4,5-5,0 с максимумом при рН 4,7. В этом же диапазоне значений концентрации ионов водорода в среде фермент проявляет высокую каталитическую активность, максимальная величина которой зафиксирована при рН 4,7 и составляет 0,42 ед/мг, что вполне согласуется с данными литературы [6, 9, 15].

С целью выявления оптимальной для выделения глюкоамилазы концентрации культуральной жидкости дрожжей фермент осаждали 80% изопропиловым спиртом из экстpaктов с 5-30% содержанием продуцента.

Установлено, что максимальные выход фермента и удельная активность (0,42 ед/мг) наблюдаются при 5% концентрации дрожжей в экстpaкте. С увеличением процента содержания продуцента в культуральной жидкости в осадок увлекается все большее количество балластных белков, что приводит к снижению выхода глюкоамилазы и уменьшению ее каталитической активности.

Таким образом, выделение глюкоамилазы целесообразно осуществлять 80% изопропиловым спиртом из 5% экстpaкта дрожжей, приготовленного на основе ацетатного буфера с рН 4,7.

Нами показано, что для осаждения глюкоамилазы из культуральной жидкости требуются большие объемы органического растворителя (1 объем экстpaкта : 4 объема изопропанола). Известно, что ультрафильтрация позволяет концентрировать и очищать от балластных соединений растворы  высокомолекулярных  веществ  [12]. Для этого применяют полупроницаемые мембраны (ацетатцеллюлозные, на полиамидной основе и др.), обладающие способностью селективно пропускать различные компоненты фильтруемой жидкости. С целью концентрирования приготовленный 5% экстpaкт культуры дрожжей S. cerevisiae ЛВ-7 подвергали ультрафильтрации на мембране УФМ-50 (диаметр пор 0,05 мкм). Установлено (табл. 1), что в фильтрат переходит незначительное количество глюкоамилазы (около 2%). Культуральная жидкость была сконцентрирована в 3 раза, удельная активность фермента возросла в 6 раз, резко увеличился выход энзима по активности (со 100 до 274,8%). Из полученного  концентрата  глюкоамилазу осаждали 80% изопропиловым спиртом. Степень очистки фермента на данной стадии составляла 9,14, а удельная активность - 1,92 ед/мг. В связи с невысоким содержанием белка в полученном препарате (39,2 мг) высаливание сульфатом аммония не осуществляли.

Гель-фильтрация на сефадексе G-25 позволила увеличить степень очистки глюкоамилазы до 41,1. Уменьшение содержания белка, более чем в 14 раз, указывает на эффективное освобождение фермента от низкомолекулярных белков (например, альбуминов с Мr = 16-32 кДа) и других примесей.

Заключительной стадией очистки глюкоамилазы была гель-хроматография на сефадексе G-150.

Элюцию фермента осуществляли ступенчато цитратно-фосфатным буфером (рН 4,7) со скоростью 12 мл/ч. Элюат собирали порциями по 3 мл и определяли в каждой из них количество белка и каталитическую активность глюкоамилазы, наиболее активные фpaкции объединяли. Выход глюкоамилазы представлен одним пиком (рис.

1).В интервале объемов выхода 20-30 мл происходило элюирование балластных белков, так как каталитической активностью данные фpaкции не обладали. Таким образом, нами был получен ферментный препарат глюкоамилазы с 70-кратной степенью очистки, удельной активностью 14,8 ед/мг (табл. 1).

Рис.1. Профиль эволюции глюкомилазы, выделенной из V_Q ,мл Saccharomyses, с колонки, упакованной сефадексом G-150

Таблица 1. Очистка глюкоамилазы из дрожжей Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7

Стадия очистки	Общая активность, ФЕ	Количество белка, мг	Удельная активность, ед/мг	Степень очистки	Выход, %
Культуральная жидкость	3628,8 22,7	384,0	0,21 0,01	1	100,0
Ультрафильтрация на УФМ-50	9972,0 37,4	554,0	1,20 0,03	5,7	274,8
Осаждение изопропиловым спиртом	752,6 6,9	39,2	1,92 0,06	9,14	20,7
Гель-фильтрация на сефадексе G-25	580,6 5,2	11,2	8,64 0,12	41,1	16,0
Гель-хроматография на сефадексе G-150	142,1 2,1	1,6	14,8 0,22	70,5	4,0

Для определения молекулярной массы фермент наносили на колонку с сефадексом G-150 вместе с маркерными белками: каталазой (Мr=200 кДа), бычьим сывороточным альбумином (Мr=68 кДа), интерфероном (Мr=22 кДа), цитохромом С (Мr=13 кДа) и инсулином (Мr=6 кДа). На основе полученных данных строили калибровочную прямую зависимости lg Мr маркерных белков от объемов выхода (Ve), по которой и была определена кажущаяся молекулярная масса глюкоамилазы, равная 99,8 кДа, что вполне согласуется с данными литературы [1, 5, 6].

Проведенный электрофоретический анализ в ПААГ показал гомогенность полученного препарата глюкоамилазы из S. сerevisiae ЛВ-7.

Литература

1. Галич И.П. Амилаза микроорганизмов. Киев.: Наук. думка. 1987. 192 с.
2. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир. 1982. Т. 1. 389 с.
3. Землянухин А.А. Большой пpaктикум по физиологии и биохимии растений. Учеб. пособие. Воронеж: Изд-во Воронежск.. ун-та. 1996. 188 с.
4. Калашников Е.Я. Производство амилолитических и протеолитических ферментов и применение их в пивоваренной промышленности. М.: ГосИНТИ. 1959. 24 с.
5. Квеситадзе Г.И. Грибные и бактериальные амилазы. Тбилиси.: Мецниереба. 1984. 154 с.
6. Котова Г.А., Котов В.Б., Сорокина А.С. Глюкоамилаза микроорганизмов. М.: Пищепромиздат. 1975. 41 с.
7. Кочетов Г.А. Пpaктическое руководство по энзимологии. М..: Высш. шк. 1980. 272 с.
8. Нестеренко М.В., Кузавлев В.А., Мосолов В.В. // Прикл. биохим. и микробиол. 1990. Т. 26. Вып. 5. С. 598.
9. Савельев А.Н., Яковлева М.Ф., Фирсов Л.Н. // Биохимия. 1984. Т. 49. Вып. 11. С. 1754.
10. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высш. шк. 1996. 335 с.
11. Ташмухамедова Ш.С., Хасанов Х.Т., Рахимов М.М. // Прикл. биохим. и микробиол. 1995. Т. 31. Вып. 3. С. 272.ё
12. Яровенко В.В. Концентрирование ферментных растворов методом ультрафильтрации. М.: ОНТИТЭИ Микробиопром. 1978. 36 с.
13. Fogarty W.M., Bourke E.J. // J. Chem. Tech. and Biotechnol. 1983. Vol. 338. P. 145.
14. Nesterenko M.V., Tilley M., Upton S.J. // J. Biochem. Biol. 1994. Vol. 28. P. 239.
15. Pazur J.H., Lui B., Bishel F. // Biotechnol. and Appl. Biochem. 1990. Vol. 12. № 1. P. 63.

---